頂空氣相色譜法測(cè)定單磷酸阿糖腺苷原料藥中5種殘留溶劑Δ

焦旭雯，陳　華，梁蔚陽(yáng)（廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州　510180）

頂空氣相色譜法測(cè)定單磷酸阿糖腺苷原料藥中5種殘留溶劑Δ

焦旭雯＊，陳華，梁蔚陽(yáng)#（廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州510180）

目的：建立測(cè)定單磷酸阿糖腺苷原料藥中乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、吡啶5種殘留溶劑的方法。方法：采用頂空進(jìn)樣氣相色譜法。色譜柱為Agilent DB-624毛細(xì)管柱，程序升溫，進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)溫度為250℃，載氣為氮?dú)猓魉贋? ml/min，進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比為1∶1，頂空平衡溫度為100℃，平衡時(shí)間為45 min，進(jìn)樣量為1 ml。按外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果：5種殘留溶劑峰分別與相鄰峰分離完全。乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、吡啶的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為24.7～296.3 μg/ml（r=0.999 6）、1.9～23.2 μg/ml（r=0.999 0）、2.8～33.6 μg/ml（r=0.998 0）、24.7～295.9 μg/ml （r=0.999 5）、1.0～11.9 μg/ml（r=0.998 6）；精密度、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤4.35%；加樣回收率分別為102.4%、102.1%、105.5%、100.3%、98.3%，RSD分別為2.0%、3.4%、4.8%、4.8%、4.0%；定量限為0.304 4～0.988 0μg/ml，檢測(cè)限為0.101 5～0.329 3μg/ml。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于單磷酸阿糖腺苷中5種原料藥殘留溶劑的檢測(cè)。

單磷酸阿糖腺苷；頂空氣相色譜法；殘留溶劑；檢測(cè)

單磷酸阿糖腺苷臨床主要用于治療慢性乙型肝炎和其他病毒性感染，如帶狀皰疹、單純皰疹、生殖器皰疹等，此外其在手足口病及兒童水痘方面也有一定的療效。該藥現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-060）-2001Z，對(duì)殘留溶劑未進(jìn)行控制，也未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道。根據(jù)不同企業(yè)的生產(chǎn)工藝，單磷酸阿糖腺苷生產(chǎn)的后3步中分別使用了乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯與吡啶等有機(jī)溶劑。為確保藥品的安全、有效和質(zhì)量可控，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版（四部）［1］的相關(guān)規(guī)定和人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）［2-3］的指導(dǎo)原則，應(yīng)增加有機(jī)溶劑的檢查。因此，筆者對(duì)單磷酸阿糖腺苷原料藥的殘留溶劑進(jìn)行了考察，建立了頂空氣相色譜法測(cè)定單磷酸阿糖腺苷原料藥中5種殘留溶劑的測(cè)定方法。

1　材料

1.1儀器

GC-6890N型氣相色譜儀，包含氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）和G1888型頂空進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；CPA225D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2試藥

單磷酸阿糖腺苷原料藥由5家企業(yè)提供（批號(hào)分別為IB200400A、111101、20130203、Y20130402、130401）；二甲基亞砜為色譜純，乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、吡啶均為分析純，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent DB-624毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，1.8 μm）［4］；程序升溫：柱溫80℃，保持5 min，再以30℃/min升至230℃，保持3 min；載氣：氮?dú)猓涣魉伲?.0 ml/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比：1∶1；進(jìn)樣口溫度：200℃；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）；檢測(cè)溫度：250℃；頂空平衡溫度：100℃（平衡時(shí)間：45 min）；進(jìn)樣量：1 ml。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液分別稱取乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和吡啶適量，用二甲基亞砜溶解并稀釋制成每1 ml含乙醇2.5 mg、乙腈0.21 mg、二氯甲烷0.3 mg、乙酸乙酯2.5 mg和吡啶0.1 mg的混合對(duì)照品貯備液。精密量取上述混合對(duì)照品貯備液5 ml，置于50 ml量瓶中，加二甲基亞砜定容，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液精密稱取樣品0.1 g，置于頂空瓶中，精密加入二甲基亞砜2 ml，密封，振搖使溶解，即得。

2.2.3空白對(duì)照溶液以二甲基亞砜作為空白對(duì)照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與專屬性考察

分別量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶劑（二甲基亞砜）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。理論板數(shù)以各待測(cè)成分峰計(jì)，詳見(jiàn)表1。由圖1、表1可知，在此色譜條件下，目標(biāo)峰位置附近無(wú)顯著干擾峰，待測(cè)成分與相鄰峰的分離度均＞1.5［5］。

圖1　氣相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.空白對(duì)照；1.乙醇；2.乙腈；3.二氯甲烷；4.乙酸乙酯；5.吡啶；6.二甲基亞砜Fig 1　GC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.blank control；1.ethanol；2.acetonitrile；3.dichloromethane；4.ethyl acetate；5.pyridine；6.DMSO

表1　理論板數(shù)與分離度Tab 1　Oretical plate number and resolution

2.4線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.5、1、2、4、6 ml，置于50 ml量瓶中，用二甲基亞砜定容，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各2 ml，分別置于頂空瓶中，密封。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見(jiàn)表2。

表2　回歸方程與線性范圍（n=5）Tab 2　Regression equations and linear ranges（n=5）

2.5定量限與檢測(cè)限考察

精密量取對(duì)照品貯備液適量，作系列稀釋后按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各峰信噪比為3∶1、10∶1時(shí)的量分別為定量限和檢測(cè)限。結(jié)果，乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、吡啶定量限分別為0.914 4、0.645 7、0.933 6、0.304 4、0.988 0 μg/ml，檢測(cè)限分別為0.304 8、0.215 2、0.311 2、0.101 5、0.329 3 μg/ml。

2.6精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、吡啶峰的RSD分別為1.9%、1.5%、0.6%、0.7%、3.6%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（IB1200400A）的樣品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算殘留溶劑的含量。結(jié)果，乙腈平均含量為0.003 0 μg/ml，RSD=4.35%，其他4種溶劑未檢出，表明本方法重復(fù)性較好［6］。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液4、5和6 ml，各置于50 ml量瓶中，加二甲基亞砜定容，搖勻，制成80%、100%和120%的低、中、高質(zhì)量濃度溶液。精密稱取已知?dú)埩羧軇┝康脑纤?.1 g，共9份，各置于頂空瓶中，再分別精密加入上述3種質(zhì)量濃度溶液各2 ml，各3份，密封，頂空進(jìn)樣。同時(shí)，制備相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，精密量取2 ml，置于頂空瓶中，密封，頂空進(jìn)樣，按外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，5種殘留溶劑的總平均回收率為98.3%～105.5%，總平均RSD為2.0%～4.8%（n=9），詳見(jiàn)表3。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9，%）Tab 3　Results of recovery tes（tn=9，%）

2.9樣品殘留溶劑測(cè)定

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批各2份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，并以外標(biāo)法計(jì)算各有機(jī)溶劑殘留量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3　討論

3.1進(jìn)樣方式的選擇

直接進(jìn)樣相比頂空進(jìn)樣操作簡(jiǎn)單，適合高沸點(diǎn)化合物的分析［7］，但由于待測(cè)樣品溶解度較差，難以找到合適的溶劑使樣品溶解，故本研究采用頂空進(jìn)樣。

3.2溶劑的選擇

單磷酸阿糖腺苷在水中極微溶解，待測(cè)溶劑二氯甲烷也不溶于水。經(jīng)考察，單磷酸阿糖腺苷經(jīng)過(guò)100℃頂空平衡后，在二甲基亞砜中溶解。二甲基亞砜在待測(cè)成分之后出峰，對(duì)乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯與吡啶均無(wú)干擾，故選擇二甲基亞砜作為溶劑。

3.3柱溫的考察

待測(cè)成分沸點(diǎn)相差較大，初始柱溫為100℃時(shí)，樣品對(duì)待測(cè)溶劑乙腈有干擾。優(yōu)化程序升溫條件，將初始柱溫設(shè)定為80℃，保持5 min，再以30℃/min升至230℃，保持3 min，氮?dú)饬魉贋?.0 ml/min，5種溶劑的色譜峰均有良好的分離度。

3.4頂空瓶平衡溫度的考察

本研究比較了不同頂空瓶溫度（90、100、110℃）的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100℃時(shí)各溶劑峰的靈敏度與重復(fù)性最佳，且樣品完全溶解，故選擇100℃作為平衡溫度。

綜上所述，本研究考察了目前生產(chǎn)單磷酸阿糖腺苷的5家企業(yè)的多批樣品，建立的方法具有適用性。方法學(xué)研究結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可用于單磷酸阿糖腺苷原料藥5種殘留溶劑的檢測(cè)［8-9］。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部［S］.2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：105.

［2］ICH指導(dǎo)委員會(huì).藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求：質(zhì)量部分［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：79.

［3］李眉，馬玉楠.簡(jiǎn)介ICH關(guān)于藥品中溶劑殘留的指導(dǎo)原則［J］.中國(guó)藥師，1998，1（3）：119.

［4］崇小萌，胡昌勤.利用中等極性氣相色譜系統(tǒng)分析藥物殘留溶劑［J］.藥物分析雜志，2014，34（11）：2 048.

［5］陳汝紅，楊春巧，張軼華.頂空氣相色譜法檢測(cè)芐星青霉素原料藥中的5種殘留溶劑［J］.中國(guó)藥房，2012，23（45）：4 287.

［6］祁彩霞，楊發(fā)勝.氣相色譜法測(cè)定鹽酸左氧氟沙星原料藥中有機(jī)溶劑三氯甲烷殘留［J］.中國(guó)藥業(yè)，2014，23（12）：73.

［7］高文超，李啟艷，咸瑞卿，等.氣相色譜法測(cè)定破壁靈芝孢子粉類保健食品中8種殘留溶劑［J］.藥學(xué)研究，2014，33（11）：642.

［8］寧偉志，吳秀榮，林煥澤，等.頂空氣相色譜法測(cè)定鹽酸伐昔洛韋中的殘留溶劑［J］.中國(guó)藥房，2012，23（9）：832.

［9］溫耀明，李國(guó)琴，范建輝，等.頂空氣相色譜法測(cè)定鹽酸普拉克索中殘留溶劑［J］.中國(guó)藥事，2014，28（9）：1 001.

（編輯：申琳琳）

Determination of Five Residual Solvents in Vidarabine Monophosphate by Headspace Gas Chromatography

JIAO Xuwen，CHEN Hua，LIANG Weiyang（Guangdong Institute for Drug Control，Guangzhou 510180，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of ethanol，acetonitrile，dichloromethane，ethyl acetate，pyridine in vidarabine monophosphate.METHODS：Headspace GC was performed on the column of Agilent DB-624，programmed temperature，inlet temperature was 200℃，the detector was flame ionization detector，detecting temperature was 250℃，nitrogen was carrier gas，flow rate was 3 ml/min，split ratio was 1∶1，the top bottles equilibrium temperature was 100℃，and equilibrium time was 45 min，injection volume was 1 ml.external standard was used for quantitative analysis.RESULTS：The peaks of five residual solvents could be completely separated from the other peaks respectively，The linear rang was 24.7-296.3 μg/ml for ethanol （r=0.999 6）、1.9-23.2 μg/ml for acetonitrile（r=0.999 0），2.8-33.6 μg/ml for dichloromethane（r=0.998 0），24.7-295.9 μg/ml for ethyl acetate（r=0.999 5），1.0-11.9 μg/ml for pyridine（r=0.998 6）；RSDs of precision and reproducibility tests were lower than 4.35%；recoveries were 102.4%（RSD=2.0%，n=9）、102.1%（RSD=3.4%，n=9）、105.5%（RSD=4.8%，n=9）、100.3%（RSD=4.8%，n=9）、98.3%（RSD=4.0%，n=9）.The minimum quantifation limit was 0.304 4-0.988 0 μg/ml and the minimum detection limit was 0.101 5-0.329 3 μg/ml.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the determination of residual solvents in vidarabine monophosphate.

Vidarabine monophosphate；Headspace GC；Residual solvent；Determination

R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3408-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.29

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（No.A2015256）；廣東省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（No.2015ZX05）

＊主管藥師。研究方向：生化藥品檢驗(yàn)和藥品標(biāo)準(zhǔn)。電話：020-81887684。E-mail：jjxxww17@163.com

主任藥師。研究方向：生化藥品與生物制品檢驗(yàn)和藥品標(biāo)準(zhǔn)。電話：020-81887684。E-mail：wl-1023@163.com

2015-07-16

2016-05-18）