一測多評法同時測定山楂葉中6種有效成分的含量Δ

楊明宇，高　婧，杜義龍，李艷榮，趙勝男，潘海峰#（.承德醫學院河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北承德　067000；.承德市食品藥品檢驗檢測中心，河北承德　067000）

一測多評法同時測定山楂葉中6種有效成分的含量Δ

楊明宇1＊，高婧2，杜義龍1，李艷榮1，趙勝男1，潘海峰1#（1.承德醫學院河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北承德067000；2.承德市食品藥品檢驗檢測中心，河北承德067000）

目的：建立同時測定山楂葉中綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以牡荊素葡萄糖苷為基準峰，分別計算其與綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的相對校正因子（RCF），通過RCF計算山楂葉中上述5種成分的含量。色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18，流動相為0.1%甲酸-乙腈-四氫呋喃（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為350 nm，柱溫為30℃，進樣量為10μl。結果：綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷檢測進樣量線性范圍分別為12.50～400.0μg（r=0.999 8）、25.00～800.0μg（r=0.999 9）、31.25～1 000.0 μg（r=0.999 9）、6.470～260.0μg（r=0.999 9）、2.50～80.0μg（r=0.999 8）、9.375～300.0μg（r=0.999 9）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為99.2%～103.9%（RSD=1.6%）、97.9%～100.8%（RSD=1.2%）、99.2%～100.8%（RSD= 0.5%）、97.3%～101.3%（RSD=1.5%）、98.0%～103.0%（RSD=1.9%）、95.5%～101.5%（RSD=2.2%），n均為6。牡荊素葡萄糖苷與綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷間的RCF分別為1.119、1.009、0.706、1.063、0.830。結論：該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于6種有效成分含量的同時測定。

山楂葉；一測多評法；相對校正因子；質量控制

山楂葉為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge/Var.major N.E.Br.或山楂C.pinnatifida Bge.的干燥葉，夏、秋二季采收，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的功效，用于氣滯血瘀、胸痹心痛、胸悶憋氣、心悸健忘、眩暈耳鳴等證的治療［1］。其主要含有黃酮類和有機酸類成分［2-4］，不同樣品間各成分含量相差較大［5］，含量上的差異難免會影響臨床療效。目前，已有使用多種成分的同步測定來控制山楂葉質量的文獻報道［6-9］，但需要對照品的種類和數量均較大，由于部分對照品不易獲得或價格較貴原因，一些進行多組分質量控制的標準難以執行。近年來，有關一測多評法（QAMS）的研究報道逐漸增多，已從藥材擴展到了中藥制劑，且大多數都是針對同類成分的含量測定，主要包括皂苷類、醌類、黃酮類、有機酸類等［10-13］，但QAMS法對山楂葉有效成分測定尚未見報道。因此，筆者采用QAMS法對山楂葉中6種成分進行含量測定，既實現了多成分定量，又降低了實際生產和市場監督過程中的檢測成本。

1　材料

1.1儀器

1200 Series型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1322A在線脫氣機、G1311A四元泵、G1329A、自動進樣器G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測器、Agilent Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）；KQ-700型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；AG-245型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2試劑

綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷對照品（批號分別為110753-200413、111668-200602、111687-200602、100080-200707、111521-201004，純度均＞99%）均購自中國食品藥品檢定研究院；牡荊素葡萄糖苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0513，純度＞99%）；乙腈、甲醇、四氫呋喃為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3藥材

山楂葉藥材（見表1）由承德民族師范學院董建新教授鑒定為薔薇科山楂屬植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉。

表1　山楂葉來源Tab 1　Origin of C.pinnatifida

2　方法與結果

2.1原理

在一定范圍內成分的量（質量或濃度）與儀器響應值成正比，即：f=W/A（W表示成分的量，A表示儀器響應值）。在山楂葉的多指標質量評價時，以牡荊素葡萄糖苷（s）為內標，建立牡荊素葡萄糖苷（s）與綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷之間的相對校正因子：

式中，fsx代表內參物與待測組分之間的相對校正因子（RCF）；Cs、Cx分別代表內參物與待測物的濃度；As、Ax分別代表內參物與待測物的儀器響應值。

通過RCF計算綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金桃苷的量，同時采用外標法（ESM）計算上述成分的量：

式中，AE代表待測物的儀器響應值；a、b分別代表本公式的斜率和截距；CE代表外標法計算所得待測物質的濃度進行同步測定，以驗證計算值的準確性和可行性。

2.2色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 ml/min；波長：350 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μl。在上述色譜條件下，理論板數以綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰計均不低于5 000，分離度均≥1.5，表明系統適用性良好，詳見圖1。

表2　梯度洗脫程序Tab 2　Gradient elution program

圖1　高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；1.綠原酸；2.牡荊素葡萄糖苷；3.牡荊素鼠李糖苷；4.牡荊素；5.蘆丁；6.金絲桃苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；1.chlorogenic acid；2.vitexin glucoside；3.vitexin rhamnoside；4.vitexin；5.rutin；6.hyperoside

2.3溶液的制備

2.3.1混合對照品溶液精密稱取蘆丁對照品10.0 mg，置于10 ml量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，作為蘆丁對照品貯備液；精密稱取綠原酸對照品20.0 mg、牡荊素對照品15.0 mg、金絲桃苷對照品15.0 mg、牡荊素葡萄糖苷對照品40 mg、牡荊素鼠李糖苷對照品50 mg，置于同一50 ml量瓶中，加70%甲醇溶解，再加上述蘆丁對照品貯備液4 ml，加70%甲醇定容，制成綠原酸、牡荊素、金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、蘆丁質量濃度分別為0.40、0.30、0.30、0.80、1.00、0.08 mg/ml的混合對照品溶液。

2.3.2供試品溶液取樣品0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇25 ml，精密稱定質量，超聲（功率：700 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷，補足減失的質量，上清液以微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，既得。

2.4線性關系考察

分別量取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，按倍比稀釋法制成系列對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μl，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表3。

2.5精密度試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD分別為1.8%、0.9%、1.4%、0.7%、1.8%、0.9%（n=6），表明儀器精密度良好。

表3　回歸方程與線性范圍Tab 3　Regression equations and linear ranges

2.6穩定性試驗

取“2.3.2”項下供試品溶液（No.2）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24、48 h時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD分別為1.5%、1.1%、1.3%、0.8%、1.2%、1.9%（n=6），表明供試品溶液在48 h內基本穩定。

2.7重復性試驗

精密稱取同一批樣品（No.2）適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷含量平均值分別為0.123 5%、0.235 2%、1.053%、0.064 5%、0.104 7%、0.235 3%，RSD分別為1.5%、0.8%、0.6%、1.6%、1.9%、1.1%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.8加樣回收率試驗

取已知含量樣品（No.2）適量，共6份，分別加入一定質量的待測成分對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量并計算加樣回收率，詳見表4。

2.9RCF的計算

以牡荊素葡萄糖苷為內參物，按“2.1”項下公式（1）計算，結合“2.4”項下系列混合對照品溶液所得峰面積數據，計算牡荊素葡萄糖苷對綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的RCF值。結果，綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的RCF值分別為1.119、1.009、0.706、1.063、0.830。

2.10RCF耐用性考察

2.10.1色譜柱和HPLC儀考察試驗考察了不同HPLC系統（Agilent 1100、Agilent 1200和Agilent 1260）和不同色譜柱［Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μ m）、Agilent ZORBAX TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）］對RCF的影響，詳見表5。2.10.2實驗室考察在不同實驗室對建立的一測多評法進行復核實驗，Lab1為承德醫學院中藥研究所分析實驗室（本實驗室），Lab2為承德醫學院中藥研究所植化實驗室，Lab3為承德頸復康藥業集團有限公司技術開發中心，同為Agilent 1200色譜系統及Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱（見表6），說明了RCF在不同實驗室具有良好的可行性。

表4　加樣回收率試驗結果（n=6）Tab 4　Results of recovery test（n=6）

表5　不同儀器和色譜柱RCF考察結果（n=6）Tab 5　Results of RCF investigated by different instruments and chromatographic columns（n=6）

2.11待測成分色譜峰的定位

利用色譜峰相對保留值（其他成分保留時間與內參物保留時間比值）定位：由色譜峰相對保留值和內參物的保留時間計算出目標峰相對保留時間，再根據峰形及光譜吸收變化趨勢，即能夠在一定程度上準確判斷目標峰的位置，結果，綠原酸、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷相對保留時間的RSD分別為2.9%、1.7%、3.2%、3.4%、2.7%，表明利用相對保留值進行色譜峰的定位是可行的。

表6　不同實驗室RCF考察結果（n=6）Tab 6　Results of RCF investigated by different laboratories （n=6）

2.12樣品含量測定結果

取樣品各適量，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，詳見表7。

表7　樣品含量測定結果（n=3，%）Tab 7Results of contents determination of samples（n=3，%）

3　討論

QAMS法建立的成功與否與多種因素有關，包括外部因素和內部因素。外部因素如環境、儀器、色譜柱、實驗人員等；內部因素主要有待測成分含量、內參物含量、對照品濃度、RCF、色譜條件等。其中，待測成分含量過低是一測多評法應用中引入誤差的主要原因。

建立的QAMS法準確與否用相對誤差RE=（CECQAMS）/CE×100%來進行評價［14］（RE＜5%為考量尺度），本試驗結合“2.1”項下公式（1）（2）導出RE與待測成分濃度倒數成以下關系：

式中，Cs/As是一個定值，可由內參物的回歸方程計算得出；a、b分別為待測組分的回歸方程中的斜率和截距；fsx代表本試驗中的RCF。

根據公式（3），當牡荊素鼠李糖苷質量濃度Cb≥0.35 mg/ml、牡荊素質量濃度Cc≥1.88μg/ml、金絲桃苷質量濃度Ce≥2.2μg/ml時，采用上述建立的RCF法進行含量測定，RE均＜5%，符合考量尺度。

綠原酸和蘆丁不能用公式（3）計算得出濃度限量，通過分析，可能是回歸方程中的斜率過小的原因［15］，因此斜率過小可能是影響QAMS的又一因素，應如何解決有待進一步考察。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于山楂葉中綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷含量的同時測定。

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（編輯：張靜）

Simultaneous Determination of Six Effective Components in Crataegus pinnatifida by Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker

YANG Mingyu1，GAO Jing2，DU Yilong1，LI Yanrong1，ZHAO Shengnan1，PAN Haifeng1（1.Key Laboratory of Study and Development of Traditional Chinese Medicine in Hebei Province，Chengde Medical University，Hebei Chengde 067000，China；2.Chengde Center for Food and Drug Control，Hebei Chengde 067000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of chlorogenic acid，vitexin glucoside，vitexin rhamnoside，vitexin，rutin and hyperoside in Crataegus pinnatifida.METHODS：With reference peak of vitexin glucoside，HPLC was conducted to calculate the relative correction factor（RCF）of chlorogenic acid，vitexin glucoside，vitexin rhamnoside，vitexin，rutin and hyperoside，then the contents of above-mentioned 5 components in C.pinnatifida were calculated.The column was Agilent ZORBAX SB C18with mobile phase of 0.1%formic acid-acetonitrile-tetrahydrofuran（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 350 nm，column temperature was 30℃，and the injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 12.50-400.0μg for chlorogenic acid（r=0.999 8），25.00-800.0μg for vitexin glucoside（r=0.999 9），31.25-1 000.0μg for vitexin rhamnoside（r=0.999 9），6.470-260.0μg for vitexin（r=0.999 9），2.50-80.0μg for rutin（r=0.999 8）and 9.375-300.0μg for hyperoside（r=0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 99.2%-103.9%（RSD=1.6%，n=6），97.9%-100.8%（RSD=1.2%，n=6），99.2%-100.8%（RSD=0.5%，n=6），97.3%-101.3%（RSD=1.5%，n=6），98.0%-103.0%（RSD=1.9%，n=6）and 95.5%-101.5%（RSD=2.2%，n=6）.RCFs of vitexin glucoside with chlorogenic acid，vitexin rhamnoside，vitexin，rutin and hyperoside were 1.119，1.009，0.706，1.063 and 0.830，respectively.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and it can be sued for the simultaneous determination of 6 components in C.pinnatifida.

Crataegus pinnatifida；Quantitative analysis of multi-components by single marker；Relative correction factor；Quality control

R284.1；R927文獻標志碼A

1001-0408（2016）24-3404-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.28

河北省高等學校科學技術研究項目（No.ZD2015097）；河北省高等學校科學研究計劃項目（No.冀教科〔2015〕7號）

＊博士研究生。研究方向：中藥分析。E-mail：18518093839@163/com

教授，碩士。研究方向：中藥分析。電話：0314-2291186。E-mail：phf2301@163.com

2015-12-05

2016-03-17）