熱處理對甜瓜的蔗糖和乳酸代謝網絡通量的影響

王會松，龐廣昌，劉婷婷（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300314）

熱處理對甜瓜的蔗糖和乳酸代謝網絡通量的影響

王會松，龐廣昌*，劉婷婷
（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300314）

為了進一步了解采后熱處理對果蔬在代謝方面作用的規律，尋找甜瓜在代謝水平上最適的熱處理溫度，本研究以甜瓜為材料研究熱空氣處理對其代謝網絡通量的影響。將甜瓜放在45、50、55℃（階躍式升溫）下處理3 h后立即置于8℃下貯藏21 h，以8℃貯藏24 h為對照，得到甜瓜不同位置的糖酵解途徑、TCA循環、蔗糖合成途徑以及戊糖磷酸途徑的代謝通量。結果顯示：50℃處理組有較高的蔗糖和乳酸通量，用于熱處理最為合適。本結果通過進一步研究熱處理為提高果蔬的貯藏品質提供科學方法和理論依據。

甜瓜，熱處理，蔗糖，乳酸，代謝網絡，代謝通量

近年來將熱處理應用到果蔬的貯藏保鮮越來越多。果蔬熱處理是指對采后果蔬進行較高溫度處理，處理溫度一般為30～52℃，處理時間在幾秒至幾小時，對提高其貯藏品質有明顯的幫助［1］。研究表明在果蔬采后經過適當的熱處理之后，產生的熱休克蛋白可以在后續的低溫貯藏條件下被感應［2］，減少低溫環境對機體造成的損傷，進一步提高果蔬在低溫貯藏期間的品質。果蔬機體中某些代謝相關的酶的活性在經過熱處理之后也會降低，從而在代謝水平上影響果實的貯藏［3］。有許多報道都證實了某些果蔬在經過熱處理之后其貯藏品質得到提高［4-5］，但值得注意的是熱處理具有潛在破壞性，使用不當即對果蔬造成變色、失水、熱傷害等［4］，所以尋找到合適的熱處理溫度至關重要。

在果蔬的貯藏保鮮中，蔗糖和乳酸發揮著重要作用［6-8］。蔗糖在碳水化合物積累、交換、運輸、分解與貯藏過程中發揮重要作用。甜瓜的糖代謝屬于蔗糖積累型，果實中蔗糖代謝模式的差異將決定果實糖分積累的高低，并由此決定果實品質。乳酸和NADH+H+具有偶聯關系，能夠在細胞器、細胞和組織間穿梭［9］，這使它在調節多細胞有機體的細胞呼吸代謝、氧化磷酸化以及合成與分解代謝等方面發揮關鍵作用［10-11］，可見乳酸代謝通量實際上是反映呼吸和分解代謝的重要標志。在果蔬中，水分構成了果蔬不同組織在空間上進行物質和能量代謝的通道和聯系，使得物質和能量的交流成為一個整體，從而實現了代謝途徑和代謝網絡貫穿于果蔬的不同空間位置，而不是只發生在細胞器或者細胞間［12］，這就類似于動物機體內是通過血液的流通來構成不同細胞和組織間代謝網絡。物質和能量通過代謝網絡在多細胞生物的不同空間組織間進行交換和傳遞［13］。本研究通過對蔗糖和乳酸代謝網絡通量的研究，更能揭示果蔬在貯藏過程中機體的本質變化，以期為果蔬保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜瓜（Cucumis melo L.var.inodorus） 選取無損害，無病蟲害，成熟度（均已達到商業成熟度）一致的優質的瓜。

3 K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；HVE-50哈雅瑪高壓滅菌器 日本Hirayama Manufacturing公司；SBA-40C生物傳感器分析儀 山東省科學院生物研究所；Fluoroskan Ascent FL熒光-化學發光檢測儀 美國Thermo公司；液氮、研缽。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 基于熱處理對果蔬生理應答的方法［14-15］，對甜瓜進行空氣熱處理。具體步驟如下：將甜瓜放于氣調箱（25 cm×43 cm×19.5 cm）中，氣調比例［3］為5%O2＋2%CO2。采用微型實驗冷庫控制溫度，將溫度設置為45、50、55℃（高溫處理采用階躍式升溫方式，對熱處理效果更為有效且減少了對果蔬的損傷），高溫貯藏3 h后立即轉入8℃貯藏21 h，并且以8℃貯藏24 h作為對照。處理24 h目的是使其達到在該溫度下的熱力學穩態。每個溫度設3個平行。取出后按甜瓜中間部位2 cm厚沿赤道平面切開，將甜瓜分為如圖1的5個部分［13］，用液氮迅速冷凍，在冰浴條件下研磨，勻漿后全部轉移入離心管，以10000×g、4℃離心10 min，收集上清液，并于-20℃條件貯藏。

圖1 甜瓜部位分割圖Fig.1 The segmentation map of melon

1.2.2 甜瓜蔗糖和乳酸代謝網絡圖的構建 基于已報道的代謝網絡的研究方法及代謝網絡的構建原則［16］，選擇糖酵解、蔗糖合成途徑、戊糖磷酸途徑和TCA循環為主要代謝途徑來構建蔗糖和乳酸代謝網絡［3］。

圖2 蔗糖、乳酸代謝網絡圖Fig.2 Sucrose and lactate metabolic network diagram

1.2.3 葡萄糖、蔗糖、乳酸和NADH濃度的測定 根據圖2所建立代謝網絡，需要求得的代謝速率共有12個（r1～r12），根據代謝通量的計算原則［16］，假設胞內中間途徑代謝物處于擬穩態［在機體中胞內代謝物料平衡，這8個途徑（表1）代謝物沒有積累］，它們的質量平衡方程均為0，這樣就可以得到8個約束向量。此時該系統的自由度F=4。而代謝網絡中的NADH可通過實驗測得，則總約束向量變為9。通過實驗測定葡萄糖的變化速率r1、蔗糖變化速率r7、乳酸的變化速率r10，已知速率為4個，此方程可以得到唯一解（公式1），進而通過計算方程得到蔗糖和乳酸代謝網絡的通量。

表1 甜瓜的質量平衡方程式Table1 Metabolic flux model equation

運用SBA-40C型生物傳感器分析儀測定樣品中葡萄糖、蔗糖和乳酸的含量，用于通量的計算。NADH的測定采用Fluoroskan Ascent FL熒光-化學發光檢測儀，參考Schaefer等［17-19］的研究并進行了改進，其反應體系為（0.25 mmol/L HEPES/EDTA緩沖液，100 mmol/L KCl，10 mmol/L MgSO4，3 mmol/L 1，3-BPG，0.5 mmol/L DHAP，0.4 U/mL GAPDH）。

1.3 數據處理

使用Matlab 7.0軟件以及SPSS軟件進行了數據的計算，利用Visio 2007、Origin和Illustrator進行了相應的繪圖。

2 結果與分析

2.1 甜瓜的蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖

通過對測定的葡萄糖、蔗糖、乳酸和NADH的數據進行通量分析，利用Matlab 7.0數據處理軟件得到歸一化后的甜瓜蔗糖和乳酸代謝通量圖（圖中數據對應的先后順序為：單一8℃空白組、45℃熱處理組、50℃熱處理組、55℃熱處理組）。

2.1.1 甜瓜內果肉蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖 如圖3，在內果肉中，就葡萄糖-6-磷酸節點來看，經過熱處理之后，進入磷酸戊糖途徑的通量值都為負，而進入了蔗糖合成的途徑通量較多。就丙酮酸節點來看，熱處理之后乳酸合成通量都有所增加，但是以50℃熱處理組最多；進入TCA循環途徑的通量在經過熱處理之后有所降低。對比乳酸合成途徑通量和進入TCA循環途徑的通量，可以看出無氧呼吸大于有氧呼吸，即在內果肉當中以無氧呼吸為主，并且經過熱處理之后更傾向于進行無氧呼吸，這樣更有利于蔗糖的合成。

圖3 甜瓜內果肉蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖Fig.3 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon pulp 3

2.1.2 甜瓜中果肉蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖 如圖4所示，在甜瓜中果肉當中，就葡萄糖-6-磷酸節點來看，經過熱處理之后，進入磷酸戊糖途徑的通量值都為負，而進入了蔗糖合成的途徑通量較多，這一點與在內果肉中出現的情況比較一致，在整個果實當中，蔗糖更多的流向果實內部的果肉部分。就丙酮酸節點來看，中果肉的無氧呼吸強度大于有氧呼吸的強度，以無氧呼吸為主。

圖4 甜瓜中果肉蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖Fig.4 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon pulp 2

2.1.3 甜瓜外果肉蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖 如圖5所示，在甜瓜外果肉當中，由葡萄糖-6-磷酸節點可以看出進入磷酸戊糖途徑的通量數值不再為負，而都是正值；四個處理組的蔗糖合成通量相差不大。由丙酮酸節點可以看出，經過熱處理之后乳酸合成通量都較單一8℃空白組低，但是相差不大；并且與流向TCA循環途徑的通量相比，在外果肉當中無氧呼吸仍然占據上風。

圖5 甜瓜外果肉蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖Fig.5 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon pulp 1

2.1.4 甜瓜內果皮蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖 如圖6所示，在甜瓜內果皮當中，由葡萄糖-6-磷酸節點可以看出，在經過50℃熱處理之后進入蔗糖合成途徑的通量較其他三種情況下的通量多，這種處理條件更適合蔗糖的合成，減少果實糖分的降解。由丙酮酸節點可以看出，內果皮部分的有氧呼吸強度大于無氧呼吸的強度；并且有氧呼吸的強度隨著熱處理溫度的升高而加強，機體更傾向于增強分解代謝。

圖6 甜瓜內果皮蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖Fig.6 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon endocarp

圖7 甜瓜外果皮蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖Fig.7 Sucrose，lactate metabolic network flux in Melon epicarp

2.1.5 甜瓜外果皮蔗糖和乳酸代謝網絡通量圖 如圖7所示，在甜瓜的外果皮當中，就葡萄糖-6-磷酸節點來看，經過45℃和50℃人處理之后進入蔗糖合成途徑的通量較多，有利于果蔬的保藏；而經過55℃熱處理之后，與內果皮一樣，進入蔗糖合成途徑的通量較單一8℃空白組的數值還要低，說明在果皮部位，經過如此高的溫度處理之后反而對甜瓜起到了促進糖類物質分解的作用，有害于果蔬的保藏。就丙酮酸節點來看，甜瓜外果皮中有氧呼吸強度大于無氧呼吸，與內果皮的情況相類似，即甜瓜的有氧呼吸主要集中在果皮部位。

2.2 蔗糖代謝通量

糖分構成是影響果實品質的一個重要因素［20］，尤其是蔗糖。如圖8顯示，就整體數據而言，50℃熱處理組的蔗糖通量較單一8℃空白組的蔗糖通量高，有三個部位（內果肉、中果肉和內果皮）呈現顯著升高的趨勢，分別較對照組高出了25%、21%和29%，所以經過50℃熱處理之后更有利于蔗糖的合成，減少糖分的降解。經過45℃熱處理之后，在內果肉部位有顯著性升高的趨勢，較空白組高出了28%，其他部位（即中果肉、外果肉、內果皮以及外果皮）也都有所升高，但是并沒有呈現出顯著性的變化。經過55℃熱處理之后，在外果肉和果皮部位的蔗糖通量都要小于單一8℃空白組，可能如此高的溫度已經開始擾亂了機體的代謝，使得甜瓜的糖分開始大量的分解消耗，從而會加速果蔬的損傷。由此可以看出，經過適當的高溫處理確實會在抑制糖分分解方面起到好的效果，但是這也是有一定的高溫上限。

圖8 不同溫度處理后甜瓜從內到外五部分的蔗糖通量Fig.8 The metabolic flux of sucrose in five parts of melon fruit under different storage temperatures

2.3 乳酸代謝通量

圖9 不同溫度處理后甜瓜從內到外五部分的乳酸通量Fig.9 The metabolic flux of lactate in five parts of melon fruit under different storage temperatures

乳酸的代謝通量可以定量化的反映果蔬呼吸代謝的受限情況和合成代謝的增強情況。如圖9所示，就整體而言，經過50℃的熱處理之后，在內果肉、內果皮和外果皮三個部位的乳酸通量較空白組都有顯著的升高，尤其在內果皮和外果皮部位，分別高出了37%和53%，有效地抑制了呼吸代謝，并且為蔗糖合成的增強提供了幫助。經過45℃熱處理之后，只有外果皮部位有顯著性的升高，其他部位與空白組無較大差別。經過55℃熱處理之后，甜瓜整體部位與空白組無較大差別。

3 結論與討論

采后熱處理可以提高果蔬的貯藏品質［1-2］。在果蔬的貯藏保鮮中，蔗糖和乳酸的研究對提高貯藏品質有著重要的作用［6-8］。較高的蔗糖合成通量有助于保持和增加果實的甜度，從而對果實的品質有極大的影響；乳酸通量可以定量化描述呼吸代謝的受限程度以及合成代謝的增強程度［3］，機體由于某些原因（如常規的低溫貯藏或適當溫度的熱處理等）可以使呼吸代謝受到限制從而產生較多的乳酸，此時機體的分解代謝降低，更有利于延長果蔬的貨架期；而乳酸又會通過由果實中水分所構成的復雜的代謝網絡最終流向蔗糖合成途徑，從而使合成代謝增強，進一步保證了果實的品質。通過對蔗糖和乳酸構成的代謝網絡進行通量分析，更能從生命體（果蔬屬于活體材料）最基本的代謝水平來揭示果蔬受到外部環境影響之后是如何做出響應的，以便為更好地尋找適合貯藏的最佳條件提供更為科學的理論和方法。甚至也可以拓展到借用果蔬作為操作體系進一步研究壽命的問題（延長壽命的本質就是最大限度的降低分解代謝）。本文以蔗糖和乳酸代謝網絡通量作為研究方法，對甜瓜熱處理的結果顯示：經過50℃熱處理之后蔗糖和乳酸通量總體較高，所以作為甜瓜熱處理的溫度比較合適，這與張輝等研究的最適熱處理溫度相一致［21-22］。

在對甜瓜進行不同溫度貯藏的報道［23］中，蔗糖在高溫區出現高通量時的溫度（50℃）與本實驗的熱處理最佳溫度是一致的。蔗糖是甜瓜果實含量最多且最為穩定的糖分，根據稀溶液依數性原理，蔗糖含量的增加有利于果實抵抗一定范圍的高溫脅迫；是果實為避免高溫造成傷害的應激反應。從代謝的角度來看，隨溫度的升高所有催化中心代謝途徑的酶活性都會增大，為了避免過高的代謝所引起的損傷，生物在高溫應激的過程中只能通過降低呼吸和分解代謝途徑中酶的轉錄與翻譯來降低呼吸和分解代謝［3］，從而在后續的冷藏中進一步降低呼吸和分解代謝，達到提高貯藏質量和延長保鮮期的目的。

本研究對甜瓜在熱處理（45、50、55℃）條件下的蔗糖和乳酸代謝通量進行了測定，并且繪制了甜瓜由內到外五個部位的蔗糖與乳酸的代謝網絡通量圖。結果表明，經過50℃的熱處理之后更有利于增加蔗糖和乳酸的代謝通量，從而作為甜瓜保鮮的熱處理溫度最為合適。通過此次研究，期望進一步揭示果蔬在貯藏過程中機體的變化，為果蔬的熱處理保鮮提供理論依據。

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Effects of heat treatment on melon in sugar and lactate metabolic network flux

WANG Hui-song，PANG Guang-chang*，LIU Ting-ting
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

In order to further understand the rule of heat treatment on postharvest fruits and vegetables in the metabolism，looking for optimum heat treatment temperature of melon on the metabolism.Melon was used in this study to reveal effects of metabolic network flux at heat treatment.The melon was placed in 45，50 and 55℃for three hours，then placed hami melon immediately in optimal storage temperature 8℃ under 21 hours，as a blank to 8℃for 24 hours，the metabolic flux of embden meyerhof pathway（EMP），pentose phosphate pathway （PPP），TCA cycle（TCA）and sucrose synthesis pathway（SSP）of hami melon fruit different spatial location at different temperatures were researched.The results showed that higher sugar and lactate flux appeared in the heat treatment group of 50℃.Thus，50℃ was the optimal heat treatment temperature.This result combined with early work，to summarize the influence of heat treatment on metabolism，with a view to provide a scientific method and theory on the heat treatment to improve the quality of fruits and vegetables.

melon；heat treatment；sugar；lactate；metabolic network；metabolic flux

TS255.1

A

1002-0306（2016）06-0314-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.055

2015－07－17

王會松（1990-），男，碩士研究生，研究方向：代謝工程，E-mail：master.whs@hotmail.com。

龐廣昌（1956-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：pgc@tjcu.edu.cn。

國家自然科學基金面上項目（31371773）。