我國國家標準和行業標準中黃曲霉毒素測定方法綜述

馬海華，孫楫舟，甄 彤，張 元，4，*，夏善紅（.傳感技術國家重點實驗室，中國科學院電子學研究所，北京0090；2.中國科學院大學研究生院，北京00080；.河南工業大學信息科學與工程學院，河南鄭州45000；4.糧食信息處理與控制教育部重點實驗室，河南鄭州45000）

我國國家標準和行業標準中黃曲霉毒素測定方法綜述

馬海華1，2，3，4，孫楫舟1，甄 彤3，張 元1，4，*，夏善紅1
（1.傳感技術國家重點實驗室，中國科學院電子學研究所，北京100190；2.中國科學院大學研究生院，北京100080；3.河南工業大學信息科學與工程學院，河南鄭州450001；4.糧食信息處理與控制教育部重點實驗室，河南鄭州450001）

黃曲霉毒素廣泛存在于自然界中，能夠污染多種農作物和食品，對人類的健康造成極其嚴重的危害。目前，尚無絕對有效的措施避免黃曲霉毒素的污染，因此，制定相應的標準并進一步規范和加強對黃曲霉毒素的檢測和監控顯得尤為重要。截至到2015年1月，我國現行的針對黃曲霉毒素的國家標準和行業標準共有21個，其中有11個標準在2010～2015年發布實施。本文全面綜述了21個標準中采納的7種測定方法及其特點，其中高效液相色譜法是目前廣泛使用的最權威的確證定量測定方法，而免疫層析法則是最簡便的快速篩查定性檢測方法。在此基礎上，本文進一步討論了標準的制修訂現狀，并展望了黃曲霉毒素檢測技術的發展趨勢。

黃曲霉毒素，標準，測定，方法

黃曲霉毒素廣泛存在于自然界中，主要是黃曲霉和寄生曲霉的次級代謝產物［1］。在已經能夠分離并識別的黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）和G2（AFG2）是最主要的四種［2］。另外，當奶牛攝入受AFB1污染的飼料后，AFB1在體內轉變成黃曲霉毒素M1（AFM1），存在于奶牛的乳汁中［3］。在激發光波長為365 nm的紫外光照射下，AFB1和AFB2發射450 nm藍色熒光，AFG1和AFG2發射425 nm綠色熒光。

黃曲霉毒素是一種劇毒物質，具有嚴重的致癌性、致畸性和致突變性［4］，其中，AFB1的毒性最強。黃曲霉毒素能夠污染谷物、玉米、大米、花生、堅果、牛奶等多種農作物和食品。人或動物攝入了受黃曲霉毒素污染的食物或飼料，會造成急性中毒死亡或慢性積累致癌等極其嚴重的危害。

黃曲霉毒素對人類健康和生命的嚴重危害引起了世界的廣泛關注，許多國家及標準機構和組織紛紛制定相應的標準，規范和加強對黃曲霉毒素的檢測和監控。近十年，我國在針對黃曲霉毒素的標準制定和修訂方面發展迅速，目前，現行的標準共21個（不含1個地方標準），其中國家標準10個，行業標準11個。關于國內外真菌毒素檢測標準的制修訂現狀的綜述［5-6］已有發表，但是尚無針對我國現行國家標準和行業標準中黃曲霉毒素檢測方法的詳細論述，而且由于新的標準不斷發布實施，已有綜述中所涵蓋的標準已無法全面闡述當前的標準現狀，例如，杜英秋等［6］給出我國針對黃曲霉毒素檢測方法的標準有16個（含1個地方標準，不含1個限量標準），而2014年新增5個標準，目前共計21個。

1 黃曲霉毒素限量標準

我國衛生部2011年發布實施的食品安全國家標準GB 2761-2011［7］規定了谷物及其制品、豆類及其制品、堅果及籽類、油脂及其制品、調味品以及特殊膳食用食品中AFB1的最高限量，以及乳及乳制品和嬰幼兒配方食品中AFM1的最高限量，但是并未對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的總量做出限量要求。具體限量指標見表1［7］和表2［7］所示。

表1 食品中黃曲霉毒素B1限量指標Table1 Maximum levels of AFB1in foodstuffs

2 黃曲霉毒素測定方法

在制定食品中黃曲霉毒素限量標準的同時，進一步完善黃曲霉毒素測定方法的標準也是至關重要的。隨著檢測技術的發展，我國不斷對已有標準做出修訂并制定相應的新標準。目前，我國國家標準和行業標準中采納的黃曲霉毒素測定方法主要有7種，分別是薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS）、熒光光度法（fluorometry）、微柱篩選法（microcolumn screening）、酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫層析法（immunochromatography）。這些方法的適用范圍及檢測指標見表3。

2.1 薄層色譜法

TLC是早期應用最廣泛的真菌毒素分析技術，被列為國際分析化學師協會（AOAC）標準方法［28］。目前，我國共有4個國家標準采納TLC，分別是：GB/T 5009.22-2003［9］、GB/T 5009.23-2006［12］、GB 8381-2008［15］和GB 5009.24-2010［19］。

TLC基于黃曲霉毒素在紫外光下能夠產生熒光的物理特性，具有制備分離、定性和半定量的分析功能。首先，試樣中的黃曲霉毒素經三氯甲烷等提取、過濾，用溶劑分配凈化［9，12，19］或硅膠柱純化［15］、濃縮，滴加在硅膠G制備的薄層板上，采用單向展開或雙向展開法，用展開劑將試液層析展開、分離，在紫外燈下用目測法或薄層掃描儀熒光法檢測熒光強度。如果與黃曲霉毒素標準點對應的位置上無熒光點，則表示試樣中黃曲霉毒素的含量在檢出限（例如AFB1為5 μg/kg［9，12］）以下；如果有熒光點，則需要進行確證實驗；如果樣液中熒光強度比檢出限所顯示的強，則需進行稀釋定量，直至樣液點的熒光強度與檢出限點的熒光強度一致為止。

TLC設備簡單，易于普及，在早期使用較為廣泛。但是，傳統TLC的樣品前處理繁瑣，實驗過程較復雜，耗時長，且受樣品提取、純化、展開、分離等多種因素的影響［29］，精確性較差，逐漸被HPLC所取代［30］。

表3 標準中采納的黃曲霉毒素測定方法的比較Table3 Comparison of aflatoxins determination methods applied in standards

續表

2.2 高效液相色譜法

HPLC是當前國內外檢測黃曲霉毒素最權威的方法，也是AOAC的官方方法之一。其中，與熒光檢測器聯用的高效液相色譜法（HPLC-FLD）是目前使用最為廣泛的一種方法［31］。我國共有5個國家標準和4個行業標準采納HPLC，分別是：國家標準GB/T 18979-2003［8］、GB/T 5009.23-2006［12］、GB/T 23212-2008［17］、GB/T 5413.37-2010［18］和GB/T 30955-2014［27］，行業標準SN/T 1664-2005［10］、SN/T 1736-2006［11］、NY/T 1286-2007［13］和SN/T 3263-2012［22］。

HPLC是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，將溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測。HPLC用于黃曲霉毒素檢測時，首先，提取溶劑（甲醇、乙腈、三氯甲烷等）提取試樣中的黃曲霉毒素，提取后的溶液經過濾、凈化后，注入反相C18色譜柱，用帶熒光檢測器的高效液相色譜儀測定試樣的響應值（峰高或峰面積），外標法定量［12-13］。

為進一步提高樣品的凈化、提純程度，減小雜質干擾，7個標準［8，10-11，17-18，22，27］將HPLC與免疫親和層析技術相結合，從而提高檢測的特異性和靈敏度。免疫親和柱將黃曲霉毒素特異性抗體交聯在柱內固體支持物上，當提取液通過免疫親和柱時，黃曲霉毒素與抗體結合。用水清洗免疫親和柱，去除柱內的雜質，然后用洗脫劑（甲醇等）洗脫吸附在柱上的黃曲霉毒素。

為進一步提高檢測的靈敏度，特別是提高AFB1和AFG1的熒光強度，發展了一系列柱前衍生或柱后衍生技術，例如柱前三氟乙酸衍生［10，12-13］、柱后碘衍生［8，11］、柱后溴衍生［17，22］、柱后光化學衍生［22，27］和柱后電化學衍生［22］，其中柱前三氟乙酸衍生方法已經被采納為AOAC標準方法。柱前三氟乙酸衍生方法利用AFB1和AFG1的雙呋喃環的雙鍵結構在酸性溶液中容易水解，轉化為富含羥基的熒光強度更高的衍生物AFB2a和AFG，從而提高熒光檢測的靈敏度。

HPLC-FLD具有準確性、靈敏度和分辨率高的優點［29］，能夠同時檢測多種黃曲霉毒素，實現定性、定量分析。但是，該方法操作步驟復雜繁瑣，在分離黃曲霉毒素類似物時耗時長，由于AFB1和AFG1的熒光檢測靈敏度較低，需要增加衍生處理［33］。另外，該方法需要專業技術人員操作，所需儀器設備昂貴，主要應用在專業實驗室。

2.3 液相色譜-串聯質譜法

LC-MS結合了色譜對復雜樣品分離能力強以及質譜的選擇性好的優點，是目前黃曲霉毒素確證性檢測技術發展的方向［31］。我國在2010年發布的國家標準GB/T 5413.37-2010［18］以及在2011、2012年分別發布的行業標準NY/T 2071-2011［20］和SN/T 3136-2012［21］中將LC-MS作為黃曲霉毒素的一種測定方法。

LC-MS的液相色譜系統用于分離，質譜系統用于檢測。首先，試樣中的黃曲霉毒素經提取液提取后稀釋、過濾，再經免疫親和柱［18，21］或霉菌毒素多功能凈化柱［20］凈化，然后經液相色譜分離，電噴霧離子源離子化，采用多反應離子監測方式檢測，根據色譜保留時間和質譜碎片及其離子豐度比定性，外標法定量。

實際上，農作物等實際樣品通常受到多種霉菌毒素的污染，因此，多種霉菌毒素的同步測定具有非常重要的現實意義。LC-MS在具備高效分離的同時可實現多組分定性與定量檢測，能夠提供相對分子量和結構信息，具有高靈敏度和高選擇性，適合于微量樣品中的痕量組分分析，且無需柱前衍生和柱后衍生步驟，逐漸成為同步精確測定黃曲霉毒素及多種霉菌毒素的一種重要方法［33-34］。已有文獻報道使用HPLC-MS同時檢測AFB1和OTA等多種霉菌毒素［31，35］。但是，該方法對儀器設備、環境條件及操作人員的專業水平要求高，主要應用在部分專業實驗室［29，34］。

2.4 熒光光度法

熒光光度法是利用了物質的分子/原子輻射躍遷的原理，其發出熒光的強度與物質的濃度相關，可實現定性、定量檢測。我國共有2個國家標準和2個行業標準采納熒光光度法，分別是：國家標準GB/T 18979-2003［8］和GB/T 5413.37-2010［18］，行業標準SN/T 3263-2012［22］和NY/T 2549-2014［23］。

熒光光度法通常采用無分離直接檢測模式，為了減小干擾，提高靈敏度，標準均采用熒光光度計與免疫親和層析凈化技術相結合的方式。樣品經提取、脫脂［18］過濾后，經過免疫親和柱進行層析凈化，洗脫液中加入溴溶液衍生［8，18，22］或加入氯化汞熒光增強劑［23］，以提高測定靈敏度，用熒光光度計測定熒光強度值，計算得到黃曲霉毒素含量。

免疫層析凈化熒光光度法具有選擇性強、定量精準等優點，比TLC的靈敏度有所提高。因為采用無分離方式，所以與HPLC和LC-MS相比，操作較為簡化、儀器設備簡單，但同時正是由于該方法沒有分離功能［29］，只有檢測功能，所以只適用于黃曲霉毒素總量的測定。鑒于以上這些特點，熒光光度法通常作為一種篩選方法，對于陽性樣品采用HPLC或LC-MS進一步分離和解析。

2.5 微柱篩選法

現行標準中只有國家標準GB/T 5009.23-2006［12］采納微柱篩選法作為一種快速定性篩查方法。樣品提取液通過由硅鎂吸附劑和氧化鋁組成的微柱層析管后，黃曲霉毒素被硅鎂吸附劑吸附，雜質被氧化鋁吸附。在紫外燈下觀察結果，將層析后的樣品管依次與0、5和10 ng的AFB1標準管比較。如果樣品管內硅鎂吸附劑層與0 ng標準管一致，則為陰性（5 μg/kg以下），如果呈現藍紫色熒光，則為陽性。

微柱篩選法設備簡單、操作簡便，但是，微柱不能分離AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，所以，該方法只能檢測黃曲霉毒素的總量，是一種適用于樣品快速篩查的定性檢測方法。

2.6 酶聯免疫吸附法

ELISA是二十世紀七十年代發展起來的基于免疫學和酶促反應的檢測技術，利用抗原-抗體反應的高特異性和酶促反應的高敏感性實現對抗原或抗體的檢測，已成為AOAC官方方法之一。我國采納ELISA的有3個國家標準和1個行業標準，分別是：GB/T 5009.22-2003［9］、GB/T 17480-2008［16］、GB/T 5413.37-2010［18］和NY/T 1664-2008［14］。

ELISA有直接競爭和間接競爭兩種模式。GB/T 17480-2008［16］采用直接競爭模式，用AFB1特異性抗體包被酶標微孔板，樣品中的AFB1經過提取和稀釋處理后，與辣根過氧化物酶（HRP）標記的AFB1競爭結合酶標板中的AFB1抗體，牛血清蛋白（BSA）封閉剩余的活性位點，加入酶底物后顯色，樣品中AFB1的含量與顏色成反比。對于結果的判定，可采用目測法比較樣品液孔與標準溶液孔的顏色，也可使用酶標儀測定吸光度值。GB/T 5009.22-2003［9］采用間接競爭模式，不同之處在于，使用AFB1-BSA人工抗原包被酶標微孔板，樣品中的AFB1與定量的AFB1單克隆抗體混合，發生抗原-抗體特異性結合，然后加入到酶標微孔板，多余的游離抗體與酶標板內的AFB1-BSA結合。

黃曲霉毒素ELISA試劑盒的出現，在一定程度上縮短了檢測時間。GB/T 5413.37-2010［18］和NY/T 1664-2008［14］即采用AFM1雙流向酶聯免疫試劑盒，目測或使用酶聯免疫檢測讀數儀判讀結果，實現定性檢測。

ELISA利用抗原-抗體的親和性反應，特異性強，樣品的前處理過程較簡單，回收率較高，操作較為簡便，可以進行定性或定量測定［3，29］。但是，作為標記物的酶，其活性易受反應條件的影響，例如pH的高低或金屬離子的存在會破壞酶的活性，容易導致假陽性結果。

2.7 免疫層析法

免疫層析是一種快速篩查的定性或半定量檢測技術，近年來在黃曲霉毒素檢測應用中得到了廣泛關注。它利用毛細管作用，液體流經多孔薄膜時將未結合的反應物與結合的反應物在液體－固體界面分離開［36］，利用標記物質在試紙質控線和/或檢測線區域的顯色確定樣品的陰性或陽性結果。我國共有3個行業標準采納免疫層析法，分別是：LS/T 6108-2014［26］、NY/T 2550-2014［24］和NY/T 2548-2014［25］。

LST 6108-2014［26］規定了兩種免疫層析法：酶標記免疫層析法和膠體金免疫層析法。酶標記免疫層析法使用商用AFB1酶聯免疫檢測卡，試樣經甲醇溶液提取、過濾或離心、稀釋后，加入檢測卡中。試樣中AFB1與固相載體上的抗體結合后再與固定在檢測線的酶標二抗結合，使檢測線顯色。通過檢測線是否顯色及顯色時間長短來判定試樣中AFB1的含量。

LS/T 6108-2014［26］和NY/T 2550-2014［24］都采納了膠體金免疫層析法。試樣經提取、過濾或凈化柱凈化［24］、稀釋后，加入商用檢測卡中。試樣中的AFB1先與固定在檢測卡金標區的膠體金標記AFB1抗體結合，受毛細管作用向檢測線和質控線擴散。可用目測法［24，26］、光譜成像檢測儀或膠體金免疫層析檢測儀［24］判定結果。若質控線和檢測線均顯色，則為陰性結果；若質控線顯色，檢測線不顯色，則為陽性結果；若質控線和檢測線均不顯色，則為無效結果。

NY/T 2548-2014［25］采用時間分辨熒光免疫層析法。該方法以三價稀土離子銪作為熒光標記物，試樣經提取、過濾、凈化柱凈化后與銪標記的AFB1抗體混合，抗原-抗體的結合抑制了層析過程中抗體與固定在檢測線上的AFB1-BSA的免疫反應，使檢測線時間分辨熒光強度降低，用時間分辨熒光檢測儀通過檢測時間分辨熒光強度變化進行定量測定。

在免疫層析法中，標記物是影響檢測性能的一個重要因素。文獻報道了使用磁珠［37-38］作為抗體標記物富集和分離牛奶樣品中的AFM1或使用平均直徑為75 nm左右的金納米花［39］標記抗體作為信號放大探針，可進一步降低檢測下限，提高靈敏度。

免疫層析法操作簡單、成本低，檢測過程中一般不需要使用其他試劑，能夠實現一步現場快速檢測［40］，例如，檢測時間為5 min［26］或10 min［24］。隨著商用檢測卡的推出，該方法作為一種快速定性篩查方法得到了更廣泛的應用。但是，免疫層析法的靈敏度不高、裸眼讀取結果誤差大、實現準確定量檢測較困難。

3 黃曲霉毒素標準制修訂現狀分析與展望

在標準的制修訂時間和數量方面，我國現行的針對黃曲霉毒素的21個標準（不含1個地方標準）中的11個標準是在2010～2014年間制修訂的，可見近幾年標準的制修訂工作發展迅速。黃曲霉毒素測定方法標準一般采納一種或多種檢測方法，其中共計9個標準采納HPLC熒光檢測法，4個標準分別采納TLC、熒光光度法和ELISA，3個標準分別采納LC-MS和免疫層析法，僅1個標準采納微柱篩選法。HPLC涉及的檢測樣品種類最多，包括谷物、花生、干果、乳、乳粉、植物油脂、醬油、食醋、蜂蜜和茶葉等，說明該方法適用范圍廣，是一種權威的能夠同時檢測多種黃曲霉毒素的確證定量分析方法。LC-MS自2010年被引入標準中，而同時期，AOAC、國際標準化組織（ISO）、歐洲標準化委員會（CEN）制定的標準中尚未引入該法。LC-MS因其能夠同時精確定量并識別多種霉菌毒素，必將在今后得到更廣泛的應用。另外，2014年制定的5個標準中，有3個是針對免疫層析法，該方法是實現黃曲霉毒素快速篩查定性檢測的一個重要發展方向。

在關鍵技術方面，TLC、HPLC、熒光光度法和微柱篩選法都是利用了黃曲霉毒素在紫外光下能夠發出熒光的物理特性，通過熒光的強弱判讀和計算結果。而ELISA和免疫層析法則是基于免疫親和反應原理并結合酶或膠體金的顯色反應。另外，LC-MS利用了色譜的分離技術和質譜的檢測技術，根據色譜保留時間和質譜碎片及其離子豐度比定性和定量。同時，在樣品前處理中，HPLC、LC-MS和熒光光度法都引入免疫親和柱用于凈化提純。因此，目前現行標準中采用的檢測方法主要是基于色譜技術、質譜技術、熒光檢測技術和免疫親和技術。基于大型儀器的色譜技術和質譜技術作為多靶標物質同時檢測的主要技術，是黃曲霉毒素確證定量檢測的一個重要發展方向。基于三價稀土離子的上轉換熒光技術，因作為熒光標記物的三價稀土離子具有較長的亞穩能級壽命，是提高檢測穩定性的一個重要研究方向。基于抗原抗體結合的免疫親和技術，其選擇性主要依賴于抗體的選擇性，由于不同種黃曲霉毒素間分子結構的差別非常小，所以如何制備高選擇性的抗體是免疫親和技術的一個重要研究方向。

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［17］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局中國國家標準化管理委員會.GB/T 23212-2008牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的測定液相色譜-熒光檢測法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［18］中華人民共和國衛生部.GB 5413.37-2010食品安全國家標準乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定［S］.北京：中國標準出版社，2010.

［19］中華人民共和國衛生部.GB 5009.24-2010食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素M1和B1的測定［S］.北京：中國標準出版社，2010.

［20］中華人民共和國農業部.NY/T 2071-2011飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的測定液相色譜-串聯質譜法［S］.北京：中國標準出版社，2011.

［21］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T 3136-2012出口花生、谷類及其制品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的測定［S］.北京：中國標準出版社，2012.

［22］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T 3263-2012出口食品中黃曲霉毒素殘留量的測定［S］.北京：中國標準出版社，2012.

［23］中華人民共和國農業部.NY/T 2549-2014飼料中黃曲霉毒素B1的測定免疫親和熒光光度法［S］.北京：中國標準出版社，2014.

［24］中華人民共和國農業部.NY/T 2550-2014飼料中黃曲霉毒素B1的測定膠體金法［S］.北京：中國標準出版社，2014.

［25］中華人民共和國農業部.NY/T 2548-2014飼料中黃曲霉毒素B1的測定時間分辨熒光免疫層析法［S］.北京：中國標準出版社，2014.

［26］國家糧食局.LS/T 6108-2014糧油檢驗谷物中黃曲霉毒素B1的快速測定免疫層析法［S］.北京：中國標準出版社，2014.

［27］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局中國國家標準化管理委員會.GB/T 30955-2014飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法［S］.北京：中國標準出版社，2014.

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A review on aflatoxins determination methods in China's national and industry standards

MA Hai-hua1，2，3，4，SUN Ji-zhou1，ZHEN Tong3，ZHANG Yuan1，4，*，XIA Shan-hong1
（1.State Key Laboratory of Transducer Technology，Institute of Electronics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100080，China；3.College of Information Science and Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；4.Key Laboratory of Grain Information Processing and Control of Ministry of Education，Zhengzhou 450001，China）

Aflatoxins were widely found in nature，wich could contaminate many kinds of agriculture products and food，causing serious harm to the health of humans.Now，absolutely effective strategies do not have been developed for avoiding aflatoxins contamination.Therefore，establishing regulations and standards designed to standardize aflatoxins detection and strengthen supervision were considered to be very important.Till Jan.2015，there were totally twenty-one national and industry standards for aflatoxins existing in our country，consisting eleven standards that were issued and entered into force between 2010 and 2015.This review dealt with seven determination methods applied in standards.High performance liquid chromatography was now widely used as an authoritative quantitative confirmatory method，and High Performance Liquid Chromatography was a simple qualitative method for fast screening detection.Based on these，the current status in development and revision of the standards were further discussed.Meanwhile，the trends of technologies for aflatoxins determination were proposed.

aflatoxins；standards；determination；methods

TS207.2

A

1002-0306（2016）06-0360-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.064

2015－06－12

馬海華（1979-），女，博士研究生，講師，研究方向：生化微傳感器與霉菌毒素檢測，E-mail：mahaihua@huat.edu.cn。

張元（1961-），男，教授，研究方向：儲糧生物危害物檢測及智能信號處理與微系統技術，E-mail：zhangyuan@haut.edu.cn。

國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2012AA101608）；國家自然科學基金青年科學基金（61401433，61201389）。