食品來(lái)源副溶血性弧菌毒力基因分布及分子分型研究

陳 晶，黃建飛，劉叢叢，劉靈燕，賴(lài)小紅，楊國(guó)武，蘭全學(xué)（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院食品檢測(cè)所，廣東深圳518131）

食品來(lái)源副溶血性弧菌毒力基因分布及分子分型研究

陳 晶，黃建飛，劉叢叢，劉靈燕，賴(lài)小紅，楊國(guó)武，蘭全學(xué)*
（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院食品檢測(cè)所，廣東深圳518131）

分析食品中分離獲得的副溶血性弧菌主要毒力基因的分布特征、血清型及分子分型特點(diǎn)，為食源性副溶血性弧菌感染暴發(fā)的早期預(yù)警和疫情溯源提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。提取40株副溶血性弧菌基因組，分別用PCR檢測(cè)VcrD1、Vp1680、VopP和VcrD2基因，熒光PCR檢測(cè)tdh、trh和tlh基因。對(duì)40株菌株進(jìn)行血清型分型并采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）對(duì)其進(jìn)行分子分型。利用BioNumerics軟件對(duì)圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，建立PFGE分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)。40株菌株均未檢測(cè)到tdh、trh、VopP和VcrD2基因，tlh、VcrD1和Vp1680基因陽(yáng)性檢測(cè)率為100%。40株菌株中含有16種血清型，其中9株未分型，主要血清型為O2∶K28和O5∶K17，血清型分布呈多樣性。40株菌株共獲得39個(gè)不同的PFGE帶型，PFGE呈現(xiàn)遺傳多樣性，無(wú)優(yōu)勢(shì)帶型。本實(shí)驗(yàn)食品環(huán)境中分離的副溶血性弧菌未發(fā)現(xiàn)毒力因子，副溶血性弧菌血清型呈分散趨勢(shì)且菌株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

副溶血性弧菌，脈沖場(chǎng)凝膠電泳，血清分型，毒力基因

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，F(xiàn)ujino等［1］于1953年從食物中毒患者體內(nèi)首次分離，它廣泛分布于近海區(qū)域、魚(yú)、貝類(lèi)等海產(chǎn)品以及腌制食品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌，可以導(dǎo)致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐和頭疼等典型胃腸炎反應(yīng)，嚴(yán)重者可以引起敗血癥［2］。國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，副溶血性弧菌引起的食物中毒在發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已經(jīng)高居微生物性食物中毒之首。與該菌的致病相關(guān)的溶血素因子包括耐熱直接溶血素（tdh）、耐熱直接相關(guān)溶血素（trh）、不耐熱溶血素（tlh）。tdh和trh具有溶血活性、腸毒活性、細(xì)胞毒性和心臟毒性等生物學(xué)活性；tlh是一種非典型的磷脂酶，在卵磷脂存在的條件下具有溶血活性，主要分泌于細(xì)胞外［3］。

2002年Tagomori［4］在副溶血性弧菌基因組分析中發(fā)現(xiàn)三型分泌系統(tǒng)（T3SS）。T3SS由位于染色體1和2上的T3SS1及TSSS2兩個(gè)基因簇組成，與細(xì)菌對(duì)機(jī)體的細(xì)胞毒性和腸毒性有關(guān)，T3SS1分泌具有細(xì)胞毒性的效應(yīng)蛋白Vp1680和編碼內(nèi)膜蛋白VcrD1，T3SS2分泌具有腸毒性的效應(yīng)蛋白VopP和編碼內(nèi)膜蛋白VcrD2［5-7］。Okada等［8］研究表明T3SS2跟副溶血性弧菌致病性有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)主要研究副溶血性弧菌毒力因子tdh、trh、tlh、ToxR、UreC和ORF8，研究的菌株主要來(lái)源臨床和海產(chǎn)品環(huán)境，三型分泌系統(tǒng)的毒力基因Vp1680和VopP研究較少。

本文對(duì)不同食品來(lái)源分離獲得的副溶血性弧菌進(jìn)行tdh、trh、tlh、VopP、VcrD2、VcrD1、Vp1680毒力基因檢測(cè)、血清型分型和脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)分子分型研究，分析不同來(lái)源菌株的相關(guān)性，了解副溶血弧菌的毒力因子分布特點(diǎn)，為構(gòu)建副溶血性弧菌的基因指紋圖譜庫(kù)和分子溯源平臺(tái)提供有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

40株副溶血性弧菌 從深圳各大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市、酒店等食品樣品中分離所得，均經(jīng)GB/T 4789.7-2008《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)確認(rèn)為副溶血性弧菌；副溶血性弧菌參照株Vp08415（tdh+，trh+） 為深圳市疾控中心饋贈(zèng)，以上所有的菌株用3%氯化鈉堿性蛋白胨水37℃振蕩培養(yǎng)18 h；ExTaq聚合酶、qPCR聚合酶、DNA Marker和基因組提取試劑盒 Takara；副溶血性孤菌診斷血清 日本生研株式會(huì)社公司；實(shí)驗(yàn)中所用引物見(jiàn)表1。

Agilent Mx3005P熒光PCR儀 Agilent公司；PCR儀和PFGE電泳儀CHEF DR-Ⅱ BIO-RAD公司。

1.2 毒力基因檢測(cè)

試劑盒提取40株副溶血性弧菌基因組，以此為模板參照Tsai等［9］PCR體系擴(kuò)增VcrD1、Vp1680、VopP 和VcrD2基因。tdh、trh和tlh檢測(cè)參照Ward等［10］熒光PCR反應(yīng)體系，其中tdh和trh采用雙重?zé)晒釶CR。

1.3 血清學(xué)分型

參照診斷血清說(shuō)明書(shū)，K抗原直接用3%NaCl溶液制成的菌懸液進(jìn)行玻片凝集實(shí)驗(yàn)，3%NaCl溶液作為對(duì)照。將菌體用含3%NaCl的5%甘油溶液制成菌懸液，121℃滅菌1 h，用生理鹽水洗滌3次并制成菌懸液進(jìn)行O抗原凝集實(shí)驗(yàn)，生理鹽水作為自凝對(duì)照。

1.4 PFGE分型

參照美國(guó)疾病控制中心（CDC）使用的霍亂弧菌脈沖場(chǎng)電泳標(biāo)準(zhǔn)方法［11］，對(duì)40株副溶血弧菌進(jìn)行PFGE分型。分別用NotI和XbaI限制性?xún)?nèi)切酶酶切副溶血性弧菌膠塊和參考菌株沙門(mén)氏菌H9812膠塊。電泳參數(shù)分為兩部分：電壓6.0 V，轉(zhuǎn)換角度120℃，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間2 s，最終轉(zhuǎn)化時(shí)間10 s，電泳13 h；電壓6.0 V，轉(zhuǎn)換角度120℃，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間20 s，最終轉(zhuǎn)化時(shí)間25 s，電泳6 h，利用Bio Numerics軟件分析PFGE電泳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 VopP、VcrD2、VcrD1、Vp1680基因檢測(cè)結(jié)果

VcrD1和Vp1680基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)均含有目的條帶，跟預(yù)期條帶500 bp相符合（見(jiàn)圖1和圖2），VopP和VcrD2都未檢測(cè)到目的條帶。

2.2 tdh、trh和tlh熒光結(jié)果

40株副溶血性弧菌均未檢測(cè)到tdh、trh基因，tlh陽(yáng)性率為100%，結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與陳茂義等［12］對(duì)水產(chǎn)品和環(huán)境中分離的81株副溶血性弧菌結(jié)果相同。

2.3 血清型分布

40株副溶血性弧菌共鑒定出16種血清型（O抗原有8種分型，K抗原有16種分型），其中9株為不可分型。主要血清型為O2∶K28、O5∶K17、O1∶K32、O3∶K43、O4∶K34，所占比例分別為15%、12.5%、7.5%、7.5%、7.5%，其他血清型各1株，包括O6∶K46、O3∶K5、O1∶K32、O3∶K30、O1∶KUT、O5∶KUT等，血清型多樣化，呈分散趨勢(shì)。其中O1∶KUT、O5∶KUT是1996年后引起多起暴發(fā)的主要血清型，該血清型菌株和O3∶K6共同參與組成“大流行菌群”［13］。

表1 實(shí)驗(yàn)中常用引物Table1 Primers used in this study

圖1 VcrD1片段凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of VcrD1 fragements

圖2 Vp1680片段凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Vp1680 fragements

2.4 PFGE分析

Wagley S等［14］實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)副溶血性弧菌環(huán)境分離株與臨床分離株存在相同的克隆型。因此，運(yùn)用PFGE方法對(duì)各種來(lái)源的菌株進(jìn)行分子分型具有現(xiàn)實(shí)意義。通過(guò)PFGE分析，40株副溶血性弧菌得到39種帶型，各菌株DNA條帶為12～20條，條帶分子量最大為1221 kb，最小為18.84 kb，無(wú)優(yōu)勢(shì)帶型，呈現(xiàn)遺傳多樣性（見(jiàn)圖4）。經(jīng)類(lèi)聚分析，菌株間相似性集中在30%～60%之間。同一血清型菌株的PFGE圖譜之間存在至少有7條帶以上差異，如6株O2∶K28和5株O5∶K17，為不相關(guān)菌株。在30%相似水平上可分為4（A1～A4）個(gè)群，其中A3群含有29株，占72.5%，17株菌來(lái)自海產(chǎn)品（14株來(lái)自海水魚(yú)，2株來(lái)自蝦，1株來(lái)自貝類(lèi)），1株來(lái)自淡水魚(yú)，7株來(lái)自豬肉和雞肉，4株來(lái)自涼菜。A1含有8株，占20%，其中有2株P(guān)FGE帶型完全相同，分別來(lái)自鮮榨胡蘿卜汁和雞肉，表明其受同一克隆菌株的污染。

圖3 tdh、trh和tlh熒光PCRFig.3 Real-time fluorescent PCR of tdh，trh and tlh

圖4 PFGE分型聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.4 PFGE patterns of vibrio parahaemlyticus isolates

3 結(jié)論

毒力基因tdh、trh、VopP和VcrD2結(jié)果為陰性，tlh、vcrD1和VP1680基因檢出率100%。tlh和T3SS1在臨床分離株和環(huán)境分離株中均存在，具有菌種特異性。副溶血性弧菌來(lái)源多樣，20株來(lái)源于海產(chǎn)品（18株來(lái)自海魚(yú)，1株來(lái)自生蠔，1株來(lái)自?xún)鑫r），1株來(lái)自淡水魚(yú)，11株來(lái)自雞肉和豬肉，7株來(lái)自即食菜肴，1株來(lái)自榨果汁，顯示交叉污染嚴(yán)重，應(yīng)引起重視。菌株血清型與食品種類(lèi)無(wú)相關(guān)性，血清型分布和PFGE分子分型均呈現(xiàn)多樣性，菌株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

Ottaviani等［15］發(fā)現(xiàn)4株不攜帶tdh、trh基因和T3SS2系統(tǒng)的副溶血性弧菌也能夠引起急性胃腸炎，提示存在其他未知致病因子。因此，加大監(jiān)督力度，做好食品安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警是必要的，以有效控制相關(guān)食品中該菌的污染和食物中毒的發(fā)生。

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Study on virulence genes distribution and molecular subtyping of Vibrio parahaemolyticus from different food resources

CHEN Jing，HUANG Jian-fei，LIU Cong-cong，LIU Ling-yan，LAI Xiao-hong，YANG Guo-wu，LAN Quan-xue*
（Food Testing Institute，Shenzhen Academy of Metrology&Quality Inspection，Shenzhen 518131，China）

The distribution of virulence genes、serogroup and molecular subtyping of Vibrio parahaemlyticus isolated from different resources of food were analysed，which contribute to provide scientific evidence for surveillance and source tracking.Forty strains of Vibrio parahaemolyticus genomes were extracted，VcrD1，Vp1680，VopP，VcrD2 were amplified by PCR and tdh，trh，tlh genes were detected by Real-time fluorescent PCR.All of strains were subtyped by pulsed-field gel electrophoresis and serotyped.PFGE patterns were clustered by Bionumerics software.Virulence genes tdh，trh，VopP and VcrD2 were not detected，genes of tlh，VcrD1 and Vp1680 were all positive detected.Sixteen serotypes were observed，the serotyping of 9 isolates failed.The major were O2∶K28and O5∶K17.No predominant serotype was detected.Thirty-nine PFGE patterns were detected and no predominant pattern.No virulence genes were detected.The isolates from food resource showed diversified serotype feature and far genetic distance.

Vibrio parahaemlyticus；PFGE；serogroup；virulence genes

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0239-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.041

2015－07－21

陳晶（1976-），女，碩士，工程師，研究方向：食品微生物檢測(cè)，E-mail：59420435@qq.com。

蘭全學(xué)（1977-），男，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：食品微生物檢測(cè)，E-mail：61723585@qq.com。