乳酸菌發酵提高麥胚可溶性蛋白和總酚含量及抑制脂質體氧化能力的研究

伍 娟，曾曉嬌，程 宇，董 英（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

乳酸菌發酵提高麥胚可溶性蛋白和總酚含量及抑制脂質體氧化能力的研究

伍 娟，曾曉嬌，程 宇，董 英
（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

以可溶性蛋白及總酚含量為指標，在單因素實驗基礎上，采用正交實驗設計優化乳酸菌發酵麥胚的條件，并考察了發酵產物在脂質體體系下的抗氧化能力。結果表明，起始pH影響顯著，可溶性蛋白和總酚累積的最適發酵條件分別為pH5.0、VB6濃度150 μmol/L、發酵時間12 h、發酵溫度35℃及pH5.0、VB6濃度100 μmol/L、發酵時間36 h、發酵溫度35℃。在優化條件下，麥胚發酵產物水溶性組分中蛋白及總酚含量分別為24.86 mg/mL和0.876 mg/mL，比原料提高了1.74和1.45倍。同時，乳酸菌發酵提高了麥胚水溶性組分抑制脂質體氧化的能力，其脂質體氧化抑制率可達45.5%。通過對·OH清除及對Fe2+螯合能力的實驗表明，麥胚發酵產物抑制脂質體氧化的能力與其羥基自由基清除能力有關。

麥胚，乳酸菌，發酵，可溶性蛋白，總酚，脂質體氧化

開發麥胚為原料的食品或是從麥胚中提取胚芽油是麥胚綜合利用的主要途徑［1］。而近年來麥胚的微生物轉化則為小麥制粉副產物的麥胚提供了一條新的綜合利用途徑［2-3］。由于麥胚營養成分豐富，利用微生物的生物傳化作用不僅可以改善其營養價值，還可以提高其功能性，如抗腫瘤和抗氧化活性等［2-4］。其中，利用微生物如酵母和乳酸菌的生物轉化作用提高麥胚抗腫瘤活性的研究較多，而利用微生物生物轉化作用改善麥胚抗氧化活性的研究則較少。Dordevic＇等［4］的研究表明，麥胚經乳酸菌發酵后其抗氧化活性得到了提高，這與麥胚乳酸菌發酵產物中總酚含量的增加有一定正相關性。本課題組前期的研究也表明以麥胚蛋白為原料進行酶水解能提高麥胚蛋白的抗氧化活性［5-6］。由于蛋白酶水解物和多酚類化合物已是公認的天然抗氧化物質，因此麥胚經乳酸菌發酵后生成的可溶性蛋白（多肽）及多酚則可能是其實現抗氧化功能的物質基礎。因而，利用微生物的內源酶提高麥胚發酵產物中多酚含量并同時提高可溶性蛋白（多肽）的轉化率就有可能進一步改善麥胚的功能性質。

在前期的研究中，課題組利用分離的植物乳桿菌發酵麥胚提高了脫脂麥胚中γ-氨基丁酸的含量［7］，但是對乳酸菌發酵麥胚的抗氧化功能還未了解。目前，國內對乳酸菌發酵麥胚的研究還不多。本研究擬在前期研究所探討的單因素基礎上，通過正交實驗設計考察影響發酵產物水溶性組分中的可溶性蛋白和總酚含量的變化以及其體外抗氧化活性的因素，以此探討麥胚乳酸菌生物轉化產物作為天然抗氧化功能配料的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）直投式發酵劑 實驗室自制，活菌數為5～7×1010cfu/g；脫脂麥胚 安陽漫天雪食品制造有限公司；Ferrozine Sigma-Aldrich公司，分析純；福林酚試劑、牛血清清蛋白、沒食子酸標準品、硫代巴比妥酸、BHA及其他試劑 中國醫藥（集團）上海化學試劑有限公司，分析純；實驗用水 自制，純水。

UV-1801紫外/可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；TG16－WS臺式高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；HG15A高速乳化均質機 大韓科學株式會社；KQ2200DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FM搖床 上海福瑪實驗設備有限公司；

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 參考前期研究［7］。在250 mL錐形瓶中取一定量麥胚（10 g）、乳酸菌（加菌量為麥胚的4%）和吡哆素（100 μmol/L）溶于50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖鹽（pH4.2），料液比為1/7（g/mL），紗布封口錐形瓶后將其放在搖床（100 r/min）中發酵（35℃、24 h），發酵結束后5000 r/min離心發酵液15 min，取上清液保存于4℃備用。在此基礎上，每次改變一個單因素條件考察單因素，包括發酵溫度（25、30、35、40℃）、發酵起始pH（pH3.5、4.0、4.2、4.5、5.0）、吡哆素添加量（0、50、100、150、200 μmol/L）、發酵時間（0、12、18、24、30、36 h）、以及緩沖鹽種類（醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-磷酸氫鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉）對麥胚發酵產物水溶性組分中蛋白和總酚含量的影響。

1.2.2 發酵條件優化及驗證 在單因素實驗基礎上，以可溶性蛋白和總酚含量為評價指標，選取發酵時間、吡哆素以及起始pH三個因素，采用L9（34）正交實驗設計優化可溶性蛋白和總酚累積的發酵條件（發酵溫度35℃，醋酸-醋酸鈉緩沖體系）。同時，測定不同實驗條件得到的發酵產物抑制脂質體氧化能力，分析麥胚發酵產物中可溶性蛋白和總酚含量與脂質體抑制能力之間的相關性。正交實驗的因素水平表見表1，各因素三個水平按隨機順序排列［8-9］。

表1 正交實驗因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.3 發酵產物水溶性組分中可溶性蛋白、總酚含量的測定 可溶性蛋白含量測定采用雙縮脲法［10］，總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法［11］。

1.2.4 脂質體的制備及氧化實驗 以稀釋5倍的發酵上清液為待測樣品，參考張欣等［12］的方法。

1.2.5 麥胚發酵產物水溶性組分亞鐵離子螯合能力的測定 以稀釋5倍的發酵上清液為待測樣品，BHA為對照，參照Wang等的方法［13］。

1.2.6 麥胚發酵產物水溶性組分羥自由基清除能力測定 以稀釋5倍的發酵上清液為待測樣品，BHA為對照，參照Li等的方法［14］。

1.2.7 統計分析 所有實驗在不同時間經過兩次以上重復（n≥2），每次重復實驗進行三次平行實驗，實驗所得數據進行方差分析，統計軟件為DPS。

2 結果與討論

2.1 緩沖體系對麥胚發酵產物水溶性組分中可溶性蛋白和多酚累積的影響

由于乳酸菌發酵會累積乳酸，這會導致發酵過程發酵液的pH的下降，為維持體系的pH則需要采用緩沖體系，而不同的緩沖體系具有不同的緩沖能力，因此選擇合適的緩沖體系有利于麥胚蛋白的轉化和水溶性多酚的累積。不同緩沖鹽對麥胚乳酸菌發酵產物水溶性組分中可溶性蛋白和總酚累積的影響如圖1所示。研究結果表明，緩沖鹽為醋酸-醋酸鈉時麥胚發酵產物中的可溶性蛋白含量和其他兩種緩沖鹽相比較低（p＜0.05）。但是實驗所用三種緩沖體系得到的麥胚發酵產物中的總酚含量則沒有顯著差異（p＞0.05）。由于醋酸-醋酸鈉緩沖體系具有更寬的緩沖范圍［15］，且有利于麥胚中其他活性物質如γ-氨基丁酸的累積［7］，因而在后續實驗中選擇醋酸-醋酸鈉緩沖體系用于pH的控制。

圖1 緩沖鹽對麥胚發酵液中蛋白和總酚含量的影響Fig.1 Effect of buffer on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

2.2 發酵溫度對麥胚發酵產物水溶性組分中可溶性蛋白和多酚累積的影響

發酵溫度對麥胚乳酸菌發酵產物中蛋白和總酚含量的影響如圖2。從圖2可以看出，隨著發酵溫度的升高，發酵液中可溶性蛋白和總酚含量雖均有所增加，但并不存在顯著性差異（p＞0.05）。發酵溫度達35℃時，發酵液中可溶性蛋白含量達最大；溫度進一步提高到40℃，發酵液中的可溶性蛋白含量并沒有進一步的增加，但總酚含量略有增加。盡管溫度升高可以促進酶反應的速率，但溫度過高則可能不利于乳酸菌生長，從而破壞細胞的酶活力，不利于蛋白和多酚的累積。從實驗結果可以看出當發酵溫度達35℃時，發酵液中多酚和可溶性蛋白的累積均較好，因而在后續的研究中選擇35℃作為發酵溫度進行實驗。

圖2 發酵溫度對麥胚發酵液中蛋白和總酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

2.3 起始pH對麥胚發酵產物水溶性組分中可溶性蛋白和多酚累積的影響

圖3 起始pH對麥胚發酵液中蛋白和總酚含量的影響Fig.3 Effect of initial pH on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

由于可溶性蛋白和多酚的累積需要乳酸菌內源及外源酶的作用，而pH則是酶作用的重要影響因素之一，因此實驗利用50 mmol/L的醋酸緩沖液將麥胚發酵的起始pH控制在一定范圍考察起始pH對麥胚乳酸菌發酵產物水溶性組分中可溶性蛋白和多酚含量的影響，結果如圖3所示。初始pH為3.5、4.2和5.0時，發酵液中總酚含量較低而可溶性蛋白含量較高，初始pH為4.0和4.5時，發酵液中總酚含量較高而可溶性蛋白含量卻較低。這可能是由于pH對乳酸菌內源和外源蛋白酶以及將鍵合多酚從麥胚基質中釋放出來的水解酶的活性有不同影響有關。由于醋酸緩沖液的緩沖范圍為pH3.6～5.6［15］，因此選擇pH4.0、4.5和5.0作為正交實驗pH的三個水平。

2.4 吡哆素對麥胚發酵產物水溶性組分中可溶性蛋白和多酚累積的影響

吡哆素即VB6，通常作為輔酶參與生物的物質代謝來發揮其主要功能。VB6對麥胚乳酸菌發酵產物中蛋白和總酚含量的影響見圖4。實驗結果表明，和未添加VB6的樣品相比，添加VB6可以顯著提高麥胚乳酸菌發酵產物水溶性組分中的總酚含量（p＜0.05）。添加濃度為100 μmol/L VB6進行發酵后，發酵產物水溶性組分中的可溶性蛋白含量能得到顯著提高（p＜0.05），達20.4 mg/mL，為不添加VB6時的1.28倍。此時總酚含量為0.66mg/mL，為不添加VB6時的1.34倍。添加VB6能提高麥胚發酵產物水溶性組分中多酚及可溶性蛋白含量，這可能與添加VB6提高了相關酶的酶活力有關。通常增加輔酶的含量有利于酶活力的提高，因此正交實驗中吡哆素的三個水平選擇100、150、200 μmol/L。

圖4 VB6的添加對麥胚發酵液中蛋白和總酚含量的影響Fig.4 Effect of VB6concentration on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

2.5 發酵時間對麥胚發酵產物水溶性組分中可溶性蛋白和多酚累積的影響

脫脂麥胚經乳酸菌發酵不同時間后，測定其發酵產物水溶性組分中蛋白和總酚的含量，結果如圖5所示。從圖5中可以看出，麥胚經乳酸菌發酵后，其發酵產物水溶性組分中總酚及可溶性蛋白含量與未發酵麥胚相比均有一定程度增加（p＜0.05）。發酵36 h時，發酵液中總酚含量達到0.84 mg/mL，約為0 h時的2倍。發酵18 h時，發酵上清液中可溶性蛋白含量達20.8 mg/mL，約為0 h時的1.7倍（p＜0.05）。發酵時間繼續增加至30、36 h則會導致發酵液中可溶性蛋白含量的下降，這可能是由于部分多肽繼續降解為氨基酸有關。在發酵過程中，麥胚蛋白在乳酸菌分泌蛋白酶的作用下水解成多肽和小肽，小肽在肽酶作用下被水解生成游離氨基酸［16］。因而，隨著發酵時間的延長，發酵液中可溶性蛋白含量呈現先升后降的趨勢。實驗結果表明乳酸菌發酵能夠顯著提高麥胚水溶性組分中可溶性蛋白和總酚的含量，這與Dordevic等［4］的研究結果類似。盡管在前發酵24 h內，發酵時間為18 h時可溶性多酚和蛋白含量都較高，但是發酵24 h 和18 h的樣品中可溶性蛋白含量沒有顯著性差異（p＜0.05）。同時，雖然增加發酵時間不利于可溶性蛋白含量的提高，但是可以增加水溶性總酚的含量。因選擇發酵時間12、24、36 h用于正交實驗。

圖5 發酵時間對麥胚發酵液中蛋白和總酚含量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on soluble protein and polyphenols contents of fermented wheat germ extract

2.6 正交實驗

由于醋酸緩沖鹽體系有利于麥胚多種功能性組分的累積，而發酵溫度35℃接近乳酸菌適宜生長的溫度，并且發酵時間、吡哆素以及起始pH對麥胚中可溶性蛋白和多酚含量有一定影響，實驗選擇發酵時間、吡哆素以及起始pH三個因素進行優化。為了減少實驗誤差對優化結果判斷的影響，在進行正交實驗設計時，除了以空白列為誤差列對實驗誤差進行分析，還對不同組合下的實驗進行了兩次重復（Y11和Y12、Y21和Y22、Y31和Y32分別為兩次重復實驗的可溶性蛋白含量、多酚含量以及脂質體氧化抑制率）。在進行數據分析時，將誤差列產生的誤差和重復實驗的誤差合并用于實驗結果的分析。正交實驗結果和直觀分析結果如表2所示。正交實驗方差分析結果如表3～表5所示。

對于可溶性蛋白積累，由表2的直觀分析結果可知，實驗各因素對可溶性蛋白含量影響的效應值大小為起始pH＞VB6＞發酵時間，最優實驗方案為起始pH5.0、VB6濃度150 μmol/L、發酵時間12 h。表3方差分析結果表明起始pH對可溶性蛋白含量影響顯著（p＜0.05）。實驗的較優組合在正交表中，在此最優組合條件下增加1次重復實驗，得到發酵液中可溶性蛋白含量為24.86 mg/mL，高于正交實驗均值（24.19 mg/mL），可見優化條件合理。優化條件下得到的發酵液對脂質體氧化的抑制率為25.1%。

對于水溶性多酚的積累，由表2的直觀分析結果可知，實驗各因素對總酚含量影響的效應值大小為發酵時間＞起始pH＞VB6，實驗較優參數組合為pH5.0、VB6濃度100 μmol/L、發酵時間36 h。表4方差分析表明發酵時間和起始pH對總酚含量都有極顯著影響（p＜0.01），其中發酵時間的影響更為顯著。實驗的較優組合沒有出現在正交表中，因此在最優組合條件下進行3次重復實驗，得到發酵液中總酚含量為0.876 mg/mL，比正交實驗結果中最高組的總酚含量（0.869 mg/mL）高，可見優化條件合理。優化條件下得到的發酵液對脂質體氧化的抑制率為29.9%。

表2 正交實驗結果Table2 Results of orthogonal experiment

對于脂質體抑制能力，由表2的直觀分析結果可知，實驗各因素對脂質體氧化抑制率影響的效應值大小為起始pH＞VB6＞發酵時間，實驗較優參數組合為起始pH5.0、VB6濃度100 μmol/L、發酵時間12 h。表5的方差分析結果表明起始pH對脂質體氧化抑制率影響顯著（p＜0.05）。實驗的較優組合沒有出現在正交表中，因此在最優組合條件下進行3次重復實驗，得到發酵液水溶性組分的脂質體氧化抑制率為45.5%，比正交實驗結果中最高組的脂質體氧化抑制率（均值44.1%）高，可見優化條件合理。正交實驗表中第7號實驗結果為負值，這表明這一條件下得到的發酵產物可能有弱的促進脂質體氧化的作用。

表3 可溶性蛋白正交實驗方差分析結果Table3 Variance analytical results of soluble protein orthogonal experiments

表4 總酚正交實驗方差分析結果Table4 Variance analytical results of polyphenols orthogonal experiments

表5 脂質體氧化抑制率正交實驗方差分析結果Table5 Variance analytical results of liposome oxidation inhibition rate orthogonal experiments

2.7 麥胚發酵產物水溶性組分的體外抗氧化活性

盡管用不同指標得到的最優組合不同，但是以脂質體氧化抑制率為指標優化得到的麥胚發酵液對脂質體氧化的抑制率高于可溶性蛋白含量以及總酚含量為指標優化得到的麥胚發酵液，前者對脂質體氧化的抑制率分別比后兩者高44.8%和34.2%。為進一步明確麥胚發酵產物的抗氧化作用，對脂質體氧化抑制率為指標優化得到的麥胚發酵液亞鐵離子螯合能力以及自由基清除能力進行了分析，結果見表6。與未發酵樣品相比，麥胚發酵產物抑制脂質體氧化的能力提高了0.6倍，并且其抑制脂質體氧化的能力與0.01 mg/mL BHA相當。此時發酵產物水溶性組分的羥自由基清除率為45.1%，比未發酵樣品的羥自由基清除率提高了1.1倍。但發酵樣品的Fe2+螯合能力同未發酵樣品相比，并沒有得到提高，這可能與水溶性組分中麥胚蛋白的降解有關，蛋白經酶解后Fe2+螯合能力可能降低［13］。由上可推測清除自由基能力是麥胚發酵產物抑制脂質體氧化的重要機制之一。

表6 麥胚發酵液的抗氧化能力Table6 The antioxidant ability of fermented wheat germ extract

進一步利用SPSS中的相關性分析程序分析可溶性蛋白含量、多酚含量與脂質體氧化抑制率之間的相關性，結果表明它們之間幾乎無相關性，因此分析麥胚發酵產物水溶性組分抑制脂質體氧化不僅與多酚和蛋白含量有關，更可能與多酚的種類以及蛋白的分子量分布、氨基酸組成等參數相關。

3 結論與討論

乳酸菌發酵可提高麥胚水溶性組分中可溶性蛋白、總酚含量，其中發酵起始pH對以上兩者有顯著影響（p＜0.01）。麥胚發酵產物在醋酸緩沖體系中可溶性蛋白和總酚累積的較優發酵條件分別為：pH5.0、VB6150 μmol/L、發酵時間12 h、發酵溫度35℃，pH5.0、VB6100 μmol/L、發酵時間36 h、發酵溫度35℃。得到的可溶性蛋白和總酚含量分別為24.86 mg/mL和0.876 mg/mL，比原料提高了1.74和1.45倍。其中，可溶性蛋白是以水解蛋白的形式存在。而前人的研究表明，水解蛋白和多酚類化合物作為公認的天然來源抗氧化劑，能夠在模擬或真實的食品體系中抑制油脂氧化，但兩者的聯用可能產生加成甚至是協同增效的抗氧化效應［17］，也有可能產生拮抗效應［18］。本文表明乳酸菌發酵可以提高麥胚的脂質體氧化抑制能力。雖然麥胚發酵產物水溶性組分抗氧化能力與其羥自由基清除能力存在較好的對應關系，但是脂質體氧化抑制率與麥胚發酵產物中蛋白和多酚含量之間無顯著相關性。這表明，同時含有水解蛋白和多酚類物質的麥胚發酵產物水溶性組分盡管表現出一定的抗氧化效應，但其作用方式尚不明確，有待進一步研究。

脂質體是天然磷脂在水中分散形成的磷脂雙分子層結構，其不飽和脂肪酸酰基鏈上的雙鍵易被氧化，因而是一個研究天然來源抗氧化劑抗氧化作業的有效模型［19］，已被許多研究用于食品組分抗氧化性質的評價［17，20］。本文研究表明，脫脂麥胚經一定條件的乳酸菌發酵后，其產物水溶性組分在模擬食品體系中能較好地抑制脂質體氧化，可見脫脂麥胚乳酸菌轉化產物具有潛在的抑制油脂氧化的能力，這為開發其作為天然的抗氧化功能配料提供了理論依據，同時也為麥胚的綜合利用開辟了一個新的思路。

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Study on using lactic acid bacteria improve the content of soluble protein and total phenol of wheat germ and its ability to inhibit oxidation of liposome

WU Juan，ZENG Xiao-jiao，CHENG Yu，DONG Ying
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

On the basis of single factor trials，optimized fermentation conditions of wheat germ fermented by lactic acid bacteria were investigated using orthogonal experiment.The content of water-soluble protein and total polyphenols in fermented wheat germ was used as indicators in these trials.And the ability of fermented wheat germ to inhibit liposome oxidation was investigated.The results showed that the content of soluble protein and total polyphenols were significantly influenced by initial pH.The optimal conditions for the soluble protein content were indicated as initial pH5.0，vitamin B6concentration 150 μmol/L，fermentation time 12 h and fermentation temperature 35℃.While the optimal conditions for the total polyphenols content were indicated as initial pH5.0，vitamin B6concentration 100 μmol/L，fermentation time 36 h and fermentation temperature 35℃.The concentration of soluble protein and polyphenols in optimal conditions were 24.86 mg/mL and 0.876 mg/mL respectively，which increased by 1.74 times and 1.45 times respectively when compared with raw materials.Meanwhile，the ability of the water-soluble components of wheat germ in retarding liposome oxidation was increased by lactic acid fermentation with the inhibition rate of 45.5%.The results of·OH scavenging capacity and Fe2+chelating capacity showed that the ability of fermented wheat germ to retard liposome oxidation was related with its·OH scavenging capacity.

wheat germ；lactic acid bacteria；ferment；soluble protein；total polyphenols；liposome oxidation

TS210.9

A

1002-0306（2016）06-0233-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.040

2015－08－19

伍娟（1982-），女，博士研究生，研究方向：食品組分營養功能與生物活性，E-mail：wjfood23@163.com。

江蘇省產學研前瞻性聯合研究項目（BY2012172）；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃（CXLX12_0672）；江蘇省自然科學基金（BK20130494）；江蘇大學“骨干青年教師培養工程”。