泡菜中優(yōu)良乳酸菌篩選及特性的研究

李 靜，王 瑤，鄧毛程（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510300）

泡菜中優(yōu)良乳酸菌篩選及特性的研究

李 靜，王 瑤，鄧毛程*
（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510300）

為了獲得適用于純種強(qiáng)化發(fā)酵泡菜生產(chǎn)的優(yōu)良菌種，采用平板篩選法和發(fā)酵篩選法從泡菜中分離、篩選乳酸菌，采用形態(tài)、生理生化和16S rDNA等特性的分析技術(shù)對優(yōu)選菌種進(jìn)行鑒定，并通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究優(yōu)選菌種的發(fā)酵特性。經(jīng)篩選，獲得一株乳酸產(chǎn)量最高的菌種LP-09，該菌種被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌種LP-09的最適溫度和初始pH分別為37℃和6.0，具有較強(qiáng)的耐鹽性，在含有40 g/L NaCl的培養(yǎng)基中生長正常，在含有100 g/L NaCl的培養(yǎng)基中可緩慢發(fā)酵產(chǎn)酸；同時(shí)，菌種LP-09具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力，對200 mg/L亞硝酸鹽的降解率可達(dá)99.3%以上。

植物乳桿菌，篩選，耐鹽，亞硝酸鹽

泡菜具有美味、爽口、開胃等特點(diǎn)，是我國已有三千多年歷史的傳統(tǒng)發(fā)酵食品［1］。乳酸菌是泡菜制作過程中的優(yōu)勢微生物，對泡菜品質(zhì)具有重要影響［2］。隨著對食品安全要求的提高，我國傳統(tǒng)泡菜行業(yè)正朝著生產(chǎn)工業(yè)化和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化的方向而發(fā)展，乳酸菌強(qiáng)化發(fā)酵技術(shù)已成為了改良傳統(tǒng)泡菜的重要手段［3］。

優(yōu)良乳酸菌是實(shí)現(xiàn)純種強(qiáng)化發(fā)酵泡菜的前提，多年來人們一直致力于優(yōu)良乳酸菌篩選的研究工作。通過對泡菜中微生物的分離與鑒定，乳桿菌屬（lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）被確認(rèn)為泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌群［2-4］。研究人員已從泡菜中獲得一些具有較強(qiáng)產(chǎn)酸和耐鹽性能的植物乳桿菌（lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（lactobacillus brevis）、副干酪乳桿菌（lactobacillus paracasei）和戊糖乳桿菌（lactobacillus pentose）等［5-6］，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些植物乳桿菌降解亞硝酸鹽的能力較強(qiáng)［7-8］。泡菜發(fā)酵對乳酸菌的產(chǎn)酸、耐鹽和降亞硝酸鹽等性能均有要求，由于傳統(tǒng)泡菜發(fā)酵通常由混合菌群協(xié)同完成，盡管現(xiàn)已分離出不少優(yōu)良乳酸菌，但單一菌種較難同時(shí)滿足幾方面性能的要求，使純種強(qiáng)化發(fā)酵泡菜的實(shí)施受到一定的限制。本實(shí)驗(yàn)從泡菜中篩選乳酸菌，以期獲得兼有產(chǎn)酸、耐鹽和降亞硝酸鹽等方面良好性能的優(yōu)良菌種，并初步研究菌種的特性，為泡菜工業(yè)化生產(chǎn)提供有益的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡菜 購于廣東省雷州市菜市場；乳酸 色譜純；葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、松三糖、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸三銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、Tween-80 分析純；酪蛋白胨、牛肉粉、酵母粉 市售生化試劑；MRS培養(yǎng)基 酪蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸鎂0.2 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫1.0 g，蒸餾水1000 mL，pH6.2±0.2。

FA2204型電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；JA5003型精密電子天平 杭州中拓儀器有限公司；YX-280D型蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-100-Z型生化培養(yǎng)箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；A200型基因擴(kuò)增儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；RDY-SP1Z型核酸電泳儀 北京榮陽經(jīng)典科技有限公司；GI-1型凝膠成像系統(tǒng) 通寶達(dá)成科技（北京）有限公司；S-3000N型掃描電鏡 日本日立公司；H-7650型透射電鏡 日本日立公司；Essentia LC-15C型高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 乳酸菌的篩選

采用含有15 g/L CaCO3的MRS瓊脂培養(yǎng)基制作分離平板，將泡菜汁進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板上，置于37℃下培養(yǎng)36～48 h，挑取周圍有明顯透明圈的單菌落，再在無菌的分離平板上進(jìn)行劃線分離，然后將純化后的單菌落挑取至斜面，培養(yǎng)后保藏備用。將各菌株的斜面菌種分別接入含有20 g/L葡萄糖的MRS培養(yǎng)基中，置于37℃下培養(yǎng)48 h，采用液相色譜法分析發(fā)酵液中的乳酸產(chǎn)量，優(yōu)選乳酸產(chǎn)量最高的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1.3 乳酸菌的鑒定

分別利用普通光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和投射電鏡對優(yōu)選菌種的菌體進(jìn)行觀察。按照《Bergy's Manual of Determinative for Bacteriology》中生理生化分析方法［9］，對菌種進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)以及各種糖類利用實(shí)驗(yàn)。參照文獻(xiàn)的16S rDNA鑒定方法［10］，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′）對16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，純化后PCR產(chǎn)物的序列檢測由深圳華大基因公司完成，在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索序列的同源性，并采用Neighborjoining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 溫度對生長的影響

調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基的pH至6.0，將100 mL培養(yǎng)基裝入三角瓶，接入1環(huán)斜面菌種，分別置于28、31、34、 37、40℃下進(jìn)行培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)過程中，每隔4 h取樣進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，選擇最佳的培養(yǎng)溫度。

1.5 pH對生長的影響

將MRS培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH5.0、5.5、6.0和6.5，接入斜面菌種后，置于最佳的溫度下培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)過程中，每隔4 h采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定培養(yǎng)液的菌體數(shù)，從而選擇最佳的初始pH。

1.6 鹽度對乳酸生成的影響

在含有10 g/L葡萄糖的MRS培養(yǎng)基中，分別添加0、20、40、60、80、100 g/L的氯化鈉，調(diào)節(jié)至最佳的初始pH，接入斜面菌種，在最佳的溫度下培養(yǎng)144 h，取培養(yǎng)72、144 h的培養(yǎng)液進(jìn)行乳酸含量測定。

1.7 菌種對亞硝酸鹽的降解實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)菌種降解亞硝酸鹽的能力，在含有20 g/L葡萄糖的MRS培養(yǎng)基中添加200 mg/L的亞硝酸鈉，調(diào)節(jié)至最佳的初始pH，接入斜面菌種，在最佳的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔8 h取樣檢測殘留的亞硝酸鹽，并計(jì)算亞硝酸鹽的降解率，如下式：

降解率（%）=（降解前亞硝酸鹽含量-降解后亞硝酸鹽含量）/降解前亞硝酸鹽含量×100

1.8 乳酸的測定

測定前，培養(yǎng)液經(jīng)離心去除菌體，再經(jīng)適當(dāng)稀釋，過0.45 μm濾膜，所得濾液作為待測溶液。采用日本島津高效液相色譜儀測定乳酸，參照文獻(xiàn)的液相色譜條件［11］：色譜柱為Hypersil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇與0.01 mol/L磷酸二氫鉀的混合溶液（3∶97，v/v），用磷酸調(diào)節(jié)pH2.0；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫為30℃；檢測波長為210 nm。將乳酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成10 mg/mL的乳酸標(biāo)準(zhǔn)液，用流動(dòng)相稀釋成不同濃度，進(jìn)行高效液相色譜分析，以乳酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程。培養(yǎng)液的稀釋樣品測定后，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出稀釋樣品中的乳酸含量，培養(yǎng)液的乳酸產(chǎn)量即為：稀釋樣品中乳酸含量×稀釋倍數(shù)。

1.9 亞硝酸鹽的測定

按照GB 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的操作方法進(jìn)行測定［12］。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)良菌種的篩選

從MRS平板上挑取30株具有溶鈣圈的菌株，初步視為產(chǎn)酸菌。將這些菌株分別進(jìn)行發(fā)酵，采用高效液相色譜對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，與乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖對比，從保留時(shí)間（4.916 min）可以確定30株菌的主要產(chǎn)物均為乳酸。通過建立乳酸外標(biāo)曲線，發(fā)現(xiàn)乳酸濃度為1～5 mg/mL時(shí)的線性關(guān)系良好，其回歸方程為y=304996.18x+10785.94（其中：y為峰面積，mAU；x為乳酸濃度，mg/mL），相關(guān)系數(shù)r=0.9992。根據(jù)回歸方程對各菌株48 h的乳酸產(chǎn)量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明，乳酸產(chǎn)量低于5.5 g/L的菌株有24株，高于8.0 g/L的菌株有6株，其中產(chǎn)量較高6株菌的乳酸產(chǎn)量如圖1所示。菌種LP-09的乳酸產(chǎn)量最高，故選其為進(jìn)一步研究的菌種。

圖1 優(yōu)良菌種的乳酸產(chǎn)量Fig.1 Yield of lactic acid produced from 6 potential strains

2.2 菌種的鑒定

菌種LP-09經(jīng)革蘭氏試劑染色和顯微鏡觀察，呈陽性，菌體形態(tài)為桿狀。在掃描電鏡（10 k×）、透射電鏡（10 k×）下觀察，電鏡圖像如圖2所示，菌體無鞭毛，大小約為（1.0～2.2）μm×（0.6～0.8）μm。獲得菌種LP-09的16S rDNA序列為1438 bp，經(jīng)同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其與許多植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的同源性達(dá)99%以上。采用MEGA5.1軟件以Neighborjoining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，菌種LP-09與Lactobacillus plantarum S2S21（登錄號(hào)：KP345897.1）的親緣關(guān)系最近。通過生理生化實(shí)驗(yàn)，菌種LP-09的主要生理生化特征如表1所示。綜合16S rDNA鑒定和生理生化鑒定的結(jié)果，可確定菌種LP-09為植物乳桿菌。

圖2 在掃描電鏡和透射電鏡下的圖像Fig.2 SEM（10 k×）and TEM（10 k×）photographs of cell morphology of strain LP-09

圖3 菌種LP-09的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The sequence phylogenetic tree of strain LP-09

表1 菌株LP-09的生理生化特征Table1 Physiological and biochemical characteristics of strain LP-09

2.3 溫度對菌種生長的影響

在不同溫度下，菌種LP-09的生長情況如圖4所示。從圖4中可以看出，在各實(shí)驗(yàn)溫度下，培養(yǎng)4 h后的菌種均可進(jìn)入對數(shù)生長期。從生長速度來看，34～40℃的溫度范圍較適宜菌體生長。其中，在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，菌種生長速度最快，16 h開始進(jìn)入生長穩(wěn)定期，此時(shí)的菌落數(shù)達(dá)到最大值，故該溫度被確認(rèn)為最佳生長溫度。

圖4 不同溫度下的生長情況Fig.4 Growth status of strain under different temperature

2.4 pH對菌種生長的影響

圖5 不同pH下的生長情況Fig.5 Growth status of strain under different pH

在不同初始pH下，菌種LP-09的生長情況如圖5所示。乳酸菌生長有其最適宜的pH范圍，但在培養(yǎng)過程不控制pH的情況下，乳酸的分泌將會(huì)引起pH降低，從而對乳酸菌的生長和生理活動(dòng)產(chǎn)生影響，因而控制初始pH對菌種生長具有重要作用。在實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)，初始pH為6.0～6.5時(shí)的生長速度較快，表明此初始pH范圍適宜于菌種生長。其中，初始pH為6.0時(shí)的菌落數(shù)最大，達(dá)到生長穩(wěn)定期時(shí)間最快，故確定最佳的初始pH為6.0。從適宜生長的初始pH來看，菌種LP-09與其他植物乳桿菌是一致的［5，13］。

2.5 鹽度對乳酸生成的影響

在含有不同濃度NaCl的MRS培養(yǎng)基中，菌種LP-09產(chǎn)乳酸情況如圖6所示。在0～40 g/L的NaCl濃度范圍，鹽度對菌種影響不大，各鹽度下的乳酸產(chǎn)量變化不大，且在40 g/L的NaCl濃度下，72 h和144 h的乳酸產(chǎn)量十分接近，分別為11.25 g/L和11.89 g/L，表明菌種在72 h左右基本可以完成產(chǎn)酸作用。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到60 g/L或以上時(shí)，72 h和144 h的乳酸產(chǎn)量均有明顯的下降；且隨著NaCl濃度增大，72 h和144 h的乳酸產(chǎn)量差距趨于明顯，表明高鹽度對菌種產(chǎn)生一定的抑制作用，菌體生長和乳酸分泌較為緩慢，需要較長時(shí)間完成乳酸的積累。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5-6］，在80 g/L以上NaCl濃度下，一些耐鹽性的植物乳桿菌生長或產(chǎn)酸都比較微弱。在100 g/L的NaCl濃度下，菌種LP-09 在144 h仍可產(chǎn)乳酸2.39 g/L，具有一定的耐鹽性，在高鹽培養(yǎng)基中可進(jìn)行緩慢發(fā)酵。

2.6 亞硝酸鹽的降解

在含有200 mg/L NaNO2的MRS培養(yǎng)基中，菌種LP-09降解亞硝酸鹽的情況如圖7所示。亞硝酸鹽降解率隨著發(fā)酵時(shí)間延長而增大，其中8 h以后的增大幅度較大，至40 h達(dá)到99.3%，而后變化趨于平緩。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一些植物乳桿菌對150 mg/L NaNO2的降解率為96%～98%［7-8］，相對而言，菌種LP-09具有較強(qiáng)的降亞硝酸鹽能力。在文獻(xiàn)所報(bào)道的泡菜發(fā)酵過程中，所產(chǎn)生的亞硝酸鹽峰值一般不超過40 mg/kg［14-15］。因此，如果菌種LP-09應(yīng)用發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)，可以有效地控制泡菜的亞硝酸鹽含量。

圖7 不同時(shí)間的亞硝酸鹽降解率Fig.7 Time course of degradation rate of LP-09 acted on nitrate

3 結(jié)論

從泡菜中篩選獲得30株乳酸產(chǎn)生菌，經(jīng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和對乳酸產(chǎn)物進(jìn)行定量，優(yōu)選出乳酸產(chǎn)量最高的菌種LP-09。通過對形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA序列進(jìn)行分析，菌種LP-09被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。植物乳桿菌LP-09生長的最適溫度和初始pH分別為37℃和6.0。具有較強(qiáng)的耐鹽性，在含有40 g/L NaCl培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，72 h的乳酸產(chǎn)量達(dá)11.25 g/L；同時(shí)，在含有100 g/L NaCl培養(yǎng)基中仍可緩慢發(fā)酵產(chǎn)酸，144 h的乳酸產(chǎn)量達(dá)2.39 g/L。另外，植物乳桿菌LP-09具有很強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力，對200 mg/L亞硝酸鹽的降解率可達(dá)99.3%以上。因此，植物乳桿菌LP-09是一株具有應(yīng)用潛力的菌株。但是，仍需對其進(jìn)行泡菜發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步掌握菌種發(fā)酵特性和優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，以推動(dòng)該菌種在泡菜工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

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Screening and characterization of an excellent Lactobacillus isolated from pickle

LI Jing，WANG Yao，DENG Mao-cheng*
（Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300）

To obtain excellent and pure breed strain suitable for producing fermented vegetable products，strains were isolated，screened from pickle using plate screening as well as fermentation screening method.And then，optimizing species were identified using morphological，physiological and biochemical properties and 16S rDNA analysis technology.Finally，further study on fermentation characteristics of the target strain carried out a series of fermentation test.A strain named LP-09，with maximum lactic acid-producing，was isolated from pickle and identified as Lactobacillus plantarum.Results of fermentation tests showed that the optimal temperature and initial pH suitable for strain LP-09 were 37℃ and 6.0，respectively.Meanwhile，the strain owned better salt tolerance because it could grow normally in culture media with 40 g/L NaCl，or could keep fermenting and producing lactic acid even at 100 g/L NaCl concentration continuously and slowly.At the same time，strain LP-09 possessed quite strong ability to degrade nitrite and degradation rate of 200 mg/L nitrite could reach more than 99.3%.

lactobacillus plantarum；screen；salt tolerance；nitrite

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0229-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.039

2015－07－21

李靜（1974-），女，博士研究生，副教授，研究方向：環(huán)境科學(xué)、資源綜合利用技術(shù)，E-mail：eeslee2005@163.com。

鄧毛程（1971－），男，博士，教授，研究方向：生物工程，E-mail：dengmc@163.com。

湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A03001）；創(chuàng)新強(qiáng)校工程專項(xiàng)資金自主創(chuàng)新能力提升項(xiàng)目（1A10205，1A20105）；創(chuàng)新強(qiáng)校工程專項(xiàng)資金機(jī)制改革與協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目（1A20201）。