中心組合設計優化合生元酸馬乳中乳酸菌的生長

王小標，武 運，王 璐，苗 森，古麗娜孜，張亞南，王 威（.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊80052；2.昌吉市農產品質量安全檢驗檢測中心，新疆昌吉800；.新疆農業大學科學技術學院，新疆烏魯木齊80052）

中心組合設計優化合生元酸馬乳中乳酸菌的生長

王小標1，2，武 運1，*，王 璐3，苗 森1，古麗娜孜1，張亞南1，王 威1
（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.昌吉市農產品質量安全檢驗檢測中心，新疆昌吉831100；3.新疆農業大學科學技術學院，新疆烏魯木齊830052）

為了研究四種不同低聚糖對合生元酸馬乳中乳酸菌生長的影響，通過單因素實驗篩選出促進酸馬乳中乳酸菌生長的3種低聚糖，并運用中心組合實驗及響應面分析，優化了3種低聚糖的最佳添加量。結果表明：3種低聚糖的最佳添加量為：低聚半乳糖1.30%（W/V）、低聚異麥芽糖0.80%（W/V）、低聚木糖0.40%（W/V），在最優條件下合生元酸馬乳中乳酸菌活菌數可達到（5.97±0.16）×108CFU/mL，比優化前提高了70.57%。

酸馬乳，乳酸菌，低聚糖，中心組合設計

益生元是一類不易被人體消化，可以選擇性刺激人體腸道中益生菌生長和活性，從而有益于人體健康的食物成分［1］。目前，常用的益生元主要是一些功能性低聚糖，如低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、菊粉和大豆低聚糖等［2-4］。研究認為，益生元可以促進雙歧桿菌等有益菌的生長繁殖，并代謝產生大量的乳酸、乙酸等有機酸和細菌素等抗菌物質，抑制外源和腸道固有有害菌的生長，改善腸道菌群微生態環境，提高機體免疫力［5-7］。由于低聚糖的這些益生特性，其作為一種功能性食品原料受到了國內外學者的廣泛關注。

前人研究發現，低聚糖對乳酸菌生長的影響不僅具有菌株特異性，而且與低聚糖的聚合度、糖苷鍵類型和單糖組分密切相關［8-10］。Saminathan等［11］發現，乳桿菌菌株和發酵基質不同，11株益生乳桿菌對低聚糖的利用能力不同。Hu等［12］發現，乳桿菌僅能代謝短鏈低聚異麥芽糖，而雙歧桿菌優先利用高聚合度的低聚糖。Sharma［13］和李雅松［14］認為，低聚糖對乳酸菌的促生長作用與其濃度有一定的關系，持續增加低聚糖的添加量并不能提高乳酸菌活菌數。因此，篩選適宜的益生元對開發生產合生元具有重要的意義。

現有研究多集中于單一低聚糖對益生菌生長的影響，沒有考慮多種低聚糖復合對益生菌菌株生長的影響。本研究以酸馬乳中益生菌生長情況為評價指標，通過單因素實驗篩選出對酸馬乳中乳酸菌生長有促進作用的低聚糖，再運用中心組合實驗設計確定低聚糖的最優添加量，以提高酸馬乳中乳酸菌活菌數，開發一種新型合生元酸馬乳制品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮馬乳 購于新疆烏魯木齊南山地區；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）MLS5、乳酸乳球菌（Lactococus lactis）WLB5和馬克思克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）WWMJ1 均由新疆農業大學食品科學與藥學學院微生物實驗室提供；MRS肉湯、改良MC培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeastextractpeptonedextrosemedium，YPD）、孟加拉紅培養基 青島日水生物技術有限公司；低聚異麥芽糖（isomaltooligosaccharide，IMO）、低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）、低聚木 糖（xylooligosaccharide，XOS）、低 聚 果 糖（fructooligosaccharides，FOS） 上海陸安生物科技有限公司。

FA2014N分析天平 北京東南儀誠實驗室設備有限公司；HR40-IIA2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DHP-9052電熱恒溫培養箱、HWS-26電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；FE20K pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗

1.2.1.1 低聚異麥芽糖對酸馬乳中發酵菌株生長的影響 分別添加0.00%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的低聚異麥芽糖于新鮮馬乳中，滅菌冷卻后按6%接種量（乳酸菌∶酵母菌=1∶1，乳酸菌由1∶1的干酪乳桿菌和乳酸乳球菌組成）接種，于32℃條件下恒溫發酵48 h，考察低聚異麥芽糖對發酵酸馬乳中乳酸菌、酵母菌生長的影響，以及對酸馬乳pH和酒精含量的影響。

1.2.1.2 低聚半乳糖對酸馬乳中發酵菌株生長的影響 分別添加0.00%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的低聚半乳糖于新鮮馬乳中，滅菌冷卻后按6%接種量（乳酸菌∶酵母菌=1∶1）接種，于32℃條件下恒溫發酵48 h，考察低聚半乳糖對發酵酸馬乳中乳酸菌、酵母菌生長的影響，以及對酸馬乳pH和酒精含量的影響。

1.2.1.3 低聚木糖對酸馬乳中發酵菌株生長的影響

分別添加0.00%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的低聚木糖于新鮮馬乳中，滅菌冷卻后按6%接種量（乳酸菌∶酵母菌=1∶1）接種，于32℃條件下恒溫發酵48 h，考察低聚木糖對發酵酸馬乳中乳酸菌、酵母菌生長的影響，以及對酸馬乳pH和酒精含量的影響。

1.2.1.4 低聚果糖對酸馬乳中發酵菌株生長的影響

分別添加0.00%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的低聚半乳糖于新鮮馬乳中，滅菌冷卻后按6%接種量（乳酸菌∶酵母菌=1∶1）接種，于32℃條件下恒溫發酵48 h，考察低聚果糖對發酵酸馬乳中乳酸菌、酵母菌生長的影響，以及對酸馬乳pH和酒精含量的影響。

1.2.2 中心組合實驗設計（Central Composite Design）

在單因素實驗的基礎上，利用中心組合實驗設計，以低聚異麥芽糖、低聚半乳糖和低聚木糖的不同添加量為考察因子，以酸馬乳中乳酸菌活菌數為響應值，建立響應值與考察因子之間的二次多項回歸模型。中心組合實驗設計因素與水平編碼值見表1。

表1 中心組合實驗設計因素和水平編碼值Table1 Factors，levels，and codes of central composite design

1.2.3 活菌計數 酸馬乳中乳酸菌計數采用改良MC瓊脂培養基傾注培養，于37℃恒溫培養2 d；酵母菌計數采用孟加拉紅瓊脂培養基涂布培養，于28℃恒溫培養2 d［15］。

1.2.4 pH的測定 pH測定采用FE20K pH計。

1.2.5 酒精度的測定 采用酒精計測定酸馬乳的酒精含量［16］。

1.2.6 數據分析 采用Design-Expert 8.05軟件進行中心組合實驗設計；應用SPSS 20.0軟件進行數據分析；利用Sigmaplot 12.5軟件繪制曲線。

2 結果與分析

2.1 不同低聚糖對酸馬乳中乳酸菌生長的影響

圖1 低聚異麥芽糖對酸馬乳中發酵菌株生長、產酸及酒精度的影響Fig.1 Effect of IMO on the growth of cultures，pH and alcohol degree of koumiss

2.1.1 低聚異麥芽糖對酸馬乳中發酵菌株生長、產酸及酒精度的影響 由圖1可知，隨著低聚異麥芽糖添加量的增加，酸馬乳中乳酸菌活菌數呈現先升高后下降的趨勢，當低聚異麥芽糖的添加量為1.00%，酸馬乳中乳酸菌活菌數達到最高，為5.80×108CFU/mL，顯著高于對照組和其他濃度的低聚異麥芽糖組（p＜0.05），表明低聚異麥芽糖可以顯著促進合生元酸馬乳中乳酸菌的生長。李雅松［14］和萬榮峰［17］均發現低聚異麥芽糖對乳酸菌有生長促進作用，而且促生長效果與低聚異麥芽糖的濃度相關，酸馬乳中酵母菌的活菌數隨著低聚異麥芽糖添加量的增加呈現先降低后升高的趨勢，而且低聚異麥芽糖添加量高于0.50%時，酸馬乳中酵母菌活菌數均顯著低于對照組（p＜0.05）。可能是由于酸馬乳中乳酸菌活菌數的提高加劇了乳酸菌與酵母菌之間的營養競爭，從而使酵母菌活菌數有所下降。添加不同量的低聚異麥芽糖對酸馬乳的pH無明顯影響，發酵結束后，酸馬乳pH介于4.48～4.71之間，酒精度均在0.70%vol以上。

2.1.2 低聚半乳糖對酸馬乳中發酵菌株生長、產酸及酒精度的影響 由圖2可知，隨著低聚半乳糖添加量的增加，酸馬乳中乳酸菌活菌數呈現先升高后下降的趨勢，當低聚半乳糖的添加量為1.00%，酸馬乳中乳酸菌活菌數達到最高，為5.83×108CFU/mL，顯著高于對照組和其他濃度的低聚半乳糖組（p＜0.05），表明適當添加量的低聚半乳糖可以顯著促進合生元酸馬乳中乳酸菌的生長。賀晉艷等［18］發現α-低聚半乳糖可以促進腸道益生菌的生長。Ignatova等［19］發現低聚半乳糖的添加量對發酵乳桿菌的生長速率有顯著影響。酸馬乳中酵母菌的活菌數隨著低聚半乳糖添加量的增加呈現先降低后升高的趨勢。除添加量為1.00%外，其他濃度低聚半乳糖組酵母菌活菌數與對照組均無顯著差異（p＞0.05）。添加不同量的低聚半乳糖對酸馬乳的pH無明顯影響，發酵結束后，酸馬乳pH介于4.56～4.60之間，酒精度均在0.90%vol以上。

圖2 低聚半乳糖對酸馬乳中發酵菌株生長、產酸及酒精度的影響Fig.2 Effect of GOS on the growth of cultures，pH and alcohol degree of koumiss

2.1.3 低聚木糖對酸馬乳中發酵菌株生長、產酸及酒精度的影響 由圖3可知，當低聚木糖添加量為0.50%時，對酸馬乳中乳酸菌的生長有一定的促進作用，乳酸菌活菌為4.35×108CFU/mL。低聚木糖添加量較高時，對合生元酸馬乳中乳酸菌的生長表現出一定的抑制作用。張榮斌［20］發現低聚木糖可顯著促進腸道內乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長。當低聚木糖的添加量高于1.00%時，酸馬乳中酵母菌的活菌數均高于對照組。可能是由于低聚木糖對合生元酸馬乳中酵母菌的生長有促進作用，或者是由于乳酸菌的生長受到抑制，從而酵母菌的生長占據了優勢。添加不同量的低聚木糖對酸馬乳的pH無明顯影響，發酵結束后，酸馬乳pH介于4.34～4.36之間，酒精度均在1.20%vol以上。

圖3 低聚木糖對酸馬乳中發酵菌株生長、產酸及酒精度的影響Fig.3 Effect of XOS on the growth of cultures，pH and alcohol degree of koumiss

2.1.4 低聚果糖對酸馬乳中發酵菌株生長、產酸及酒精度的影響 由圖4可知，隨著低聚果糖添加量的增加，酸馬乳中乳酸菌活菌數逐漸下降，表明添加低聚果糖對酸馬乳中乳酸菌的生長有一定的抑制作用，與張曉峰等［21］研究結果不一致。可能是由于低聚果糖的聚合度、結構和糖苷鍵的不同導致的。高穎等［22］發現唾液乳桿菌會優先代謝利用蔗果三糖，對蔗果四糖利用率較低，不能利用蔗果五糖。低濃度的低聚果糖對酸馬乳中酵母菌的生長無明顯作用，當低聚果糖的添加量高于1.00%時，對酸馬乳中酵母菌有顯著的促生長作用（p＜0.05），可能是由于低聚果糖高濃度添加量時，合生元酸馬乳中酵母菌的生長占據優勢。添加不同量的低聚果糖對酸馬乳的pH無明顯影響，發酵結束后，酸馬乳pH介于4.33～4.43之間，酒精度均在0.50%vol以上。

圖4 低聚果糖對酸馬乳中發酵菌株生長、產酸及酒精度的影響Fig.4 Effect of FOS on the growth of cultures，pH and alcohol degree of koumiss

2.2 中心組合實驗設計

利用Design-Expert 8.05對酸馬乳中乳酸菌生長進行中心組合實驗設計，實驗設計的結果見表2。

表2 中心組合實驗設計及結果Table2 Experimental design and results of the central composite design

根據表2中心組合實驗設計結果進行回歸分析，得到合生元酸馬乳中乳酸菌活菌數（Y）對低聚半乳糖（A）、低聚異麥芽糖（B）和低聚木糖（C）添加量的擬合方程為：Y=8.77+0.028A-0.018B-0.0069C-0.02AB-0.017AC+0.0075BC-0.041A2-0.037B2-0.039C2，對擬合方程進行方差分析，結果如表3所示。

表3 回歸方程方差分析Table3 Analysis of variance of regression equations

由表3可知，本實驗建立的回歸模型極顯著（p＜0.0001）；而模型失擬項p=0.4928＞0.05，說明模型失擬項不顯著，由此說明所建立的模型具有良好的顯著性。模型決定系數R2=0.9560，校正決定系數R2Adj= 0.9165，表明該模型能較好擬合實際實驗中響應值的變化，利用此模型可以對合生元酸馬乳中乳酸菌活菌數進行分析和預測。從表3可以看出，一次項A、B和二次項A2、B2、C2對響應值的影響均為極顯著（p＜0.01），交互項AB、AC對響應值存在顯著的交互作用（p＜0.05）。

2.3 響應面分析與優化

圖5 低聚半乳糖與低聚異麥芽糖交互作用響應面圖Fig.5 Response surface for the effect of GOS and IMO on the growth of LAB

圖6 低聚半乳糖與低聚木糖交互作用響應面圖Fig.6 Response surface for the effect of GOS and XOS on the growth of LAB

圖7 低聚異麥芽糖與低聚木糖交互作用響應面圖Fig.7 Response surface for the effect of IMO and XOS on the growth of LAB

利用Design-Expert 8.05軟件對回歸模型進行響應面優化，運用Sigmaplot 12.5繪制交互項三維響應面圖（圖5～圖7），可以比較直觀看出各個因素兩兩之間交互作用對響應值的影響。由圖5～圖7可以看出，在低聚木糖添加量一定時，隨著低聚半乳糖和低聚異麥芽糖添加量的增加，合生元酸馬乳中乳酸菌活菌數先升高后降低，差異顯著，說明低聚半乳糖與低聚異麥芽糖之間的交互作用顯著；在低聚異麥芽糖添加量一定時，隨著低聚半乳糖和低聚木糖添加量的增加，合生元酸馬乳中乳酸菌活菌數先升高后降低，差異顯著，說明低聚半乳糖與低聚木糖之間的交互作用顯著。通過Design-Expert 8.05對建立的回歸方程進行參數最優化分析，可以得出合生元酸馬乳中乳酸菌活菌數最高時低聚半乳糖、低聚異麥芽糖和低聚木糖的最佳添加量，即低聚半乳糖1.25%（W/V）、低聚異麥芽糖0.80%（W/V）、低聚木糖0.43%（W/V）。在此條件下，酸馬乳中乳酸菌活菌數預測值為8.7766 lg CFU/mL。

2.4 驗證實驗

為檢驗所建立的多元回歸模型的準確性，同時考慮實驗操作方便，在低聚半乳糖1.30%（W/V）、低聚異麥芽糖0.80%（W/V）、低聚木糖0.40%（W/V）條件下進行合生元酸馬乳發酵實驗，實驗平行3次，得到的合生元酸馬乳中乳酸菌活菌數分別為（5.97±0.16）×108CFU/mL，其對數值為（8.7757±0.0116）lg CFU/mL，乳酸菌活菌數平均值為與預測值較為接近，說明該模型準確可靠，能較好預測合生元酸馬乳中乳酸菌活菌數。驗證實驗中空白對照組乳酸菌活菌數為（3.50±0.17）×108CFU/mL，優化結果與空白對照相比提高了70.57%。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，利用Design-Expert 8.05軟件對酸馬乳中乳酸菌活菌數進行了響應面優化，得出三種低聚糖的最佳添加量分別為低聚半乳糖1.30%（W/V）、低聚異麥芽糖0.80%（W/V）、低聚木糖0.40%（W/V）。在此條件下發酵的酸馬乳中乳酸菌活菌數達（5.97±0.16）×108CFU/mL。優化結果比空白對照提高了70.57%，可為合生元酸馬乳飲品開發和酸馬乳制品中乳酸菌活菌數的提高提供一定的理論參考。

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Optimization of growth of lactic acid bacteria in synbiotics koumiss by central composite design

WANG Xiao-biao1，2，WU Yun1，*，WANG Lu3，MIAO Sen1，GU Li-nazi1，ZHANG Ya-nan1，WANG Wei1
（1.College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Changji Examing and Inspection Center for Agricultural Products Safety and Quality，Changji 831100，China；3.College of Science and Technology，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

In order to study the effects of different oligosaccharides on the growth of lactic acid bacteria in synbiotics koumiss，three oligosaccharides for promoting the growth of lactic acid bacteria were screened via single factor experiment，and the optimal additions of three substrates were confirmed by central composite design and response surface analysis.The results indicated that the optimal additions of three oligosaccharides were 1.30%（W/V）of galacto-oligosaccharides，0.80%（W/V）of isomaltooligosaccharide and 0.40%（W/V）of xylooligosaccharides.Under the optimal conditions，the viable counts of lactic acid bacteria could reach up to （5.97±0.16）×108CFU/mL，which revealed an increase by 70.57%.

koumiss；lactic acid bacteria；oligosaccharides；central composite design

TS252.4

A

1002-0306（2016）06-0216-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.036

2015－07－27

王小標（1989-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail：wxiaobiao@sina.com。

武運（1965-），女，碩士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：wuyunster@sina.com。

新疆維吾爾自治區重大專項子課題（201130101-4（2）-2）；國家科技部“十二五”科技支撐項目子課題（2012BAD44B01-05）。