酶法制備黑小麥麩皮阿魏酰低聚木糖的工藝優(yōu)化

儀 鑫，孫元琳，陳樹俊，陜 方，李云龍，崔曉瑞（.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原00006；.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000；.山西省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品綜合利用研究所，山西太原000）

酶法制備黑小麥麩皮阿魏酰低聚木糖的工藝優(yōu)化

儀 鑫1，孫元琳2，*，陳樹俊1，陜 方3，李云龍3，崔曉瑞2
（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000；3.山西省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品綜合利用研究所，山西太原030031）

研究黑小麥麩皮阿魏酰低聚木糖（FOs）的酶法制備工藝。用木聚糖酶酶解水不溶性膳食纖維制備FOs，通過HPLC分析方法，并結(jié)合雙波長法和薄層層析法對(duì)FOs的含量和組成進(jìn)行分析。在加酶量、反應(yīng)時(shí)間、pH、溫度4個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的中心旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，以FOs濃度為響應(yīng)值，使用響應(yīng)面分析法對(duì)FOs的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：加酶量15.5 mg/L，酶解時(shí)間22 h，溫度46℃，pH4.8，在此條件下，F(xiàn)Os的濃度為0.4913 mmol/L。薄層層析和HPLC分析結(jié)果表明，酶解液中的低聚糖含有結(jié)合態(tài)阿魏酸，是阿魏酰低聚木糖。

黑小麥麩皮，阿魏酰低聚木糖，木聚糖酶，工藝優(yōu)化

阿魏酰低聚木糖以低聚木糖為主鏈，阿拉伯糖為側(cè)鏈，并由阿魏酸通過阿拉伯糖側(cè)鏈酯鍵連接而成。低聚木糖是一種非消化性低聚糖，可以一直到達(dá)大腸，增加人體腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量，是一種有效的雙歧因子；阿魏酸具有抗氧化、降血脂、抗血栓、抗菌消炎等功能［1］，也是一種有效的抗氧化劑，其衍生物糖酯具有更強(qiáng)的抗氧化活性［2］。阿魏酰低聚木糖兼具阿魏酸和低聚木糖這兩種物質(zhì)的特性，且因其結(jié)構(gòu)中特殊的酯鍵，使阿魏酸能溶于水，具有親水性、親脂性和非離子性，滲透性強(qiáng)，容易進(jìn)入人體線粒體發(fā)揮其抗氧化作用［3］。研究表明［4］，阿魏酰低聚木糖有著比阿魏酸更強(qiáng)的抗氧化性，在DPPH和脂質(zhì)過氧化體系中，均具有較強(qiáng)的清除能力；除此之外，可抑制蛋白非酶糖基化反應(yīng)的發(fā)生，阻止產(chǎn)物的生成，保護(hù)人體紅細(xì)胞，減少人體疾病的發(fā)生，增強(qiáng)人體的免疫力。有學(xué)者［5］在模擬的人體腸道環(huán)境中比較了阿魏酰低聚木糖和低聚木糖對(duì)雙歧桿菌的增殖效果，結(jié)果表明，阿魏酰低聚木糖對(duì)雙歧桿菌的增殖作用顯著高于低聚木糖。因而，阿魏酰低聚木糖具有增殖雙歧桿菌、改善腸道微生物菌群的作用。

黑小麥麩皮是黑小麥加工的主要副產(chǎn)物，其膳食纖維含量豐富，主要為戊聚糖、β-葡聚糖和纖維素［6］。黑小麥麩皮中含有豐富的酚酸類物質(zhì)，如阿魏酸、芥子酸、香草酸等，其中阿魏酸的含量高于普通小麥麩皮中阿魏酸的含量［7］。目前，阿魏酰低聚木糖多通過酶解不溶性膳食纖維來制備，Wang Jing等［8］從小麥麩皮中通過酶法制備阿魏酰低聚木糖，潘海曉等［9］采用酶法酶解玉米麩皮制備阿魏酰低聚木糖，盛倩倩等［10］采用纖維素酶解法從米糠中制備阿魏酰低聚木糖。關(guān)于研究黑小麥阿魏酰低聚木糖的酶法制備鮮有報(bào)道，如何充分利用黑小麥麩皮，通過酶解的方法使其釋放出生理活性物質(zhì)—阿魏酰低聚木糖是本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以黑小麥麩皮為原料，采用木聚糖酶解麩皮膳食纖維獲得阿魏酰低聚木糖（FOs）。采用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以充分提取麩皮的生物活性物質(zhì)，為黑小麥特色谷物資源的有效增值和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑小麥 由山西省農(nóng)科院棉花研究所提供；木聚糖酶（EC 3.2.1.8） 酶活≥60000 U/mg，德國Ruibio公司；標(biāo)準(zhǔn)木糖、阿拉伯糖 純度≥99.0%，美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)阿魏酸 純度≥98.0%，德國Ruibio公司；標(biāo)準(zhǔn)低聚木糖（DP2～7） 純度≥95%，山東龍力生物科技有限公司；MOPS 吉泰生物科技有限公司；α-淀粉酶 酶活≥4 U/mg，酷爾生物科技有限公司；糖化酶（酶活≥100 U/mg）、中性蛋白酶（酶活≥60 U/mg）

北京奧博星生物科技有限公司；乙酸乙酯、甲醇、氨水、苯胺、二苯胺 均為分析純。

LC1200型高效液相色譜儀、Cary5000紫外-可見-近紅外分光光度計(jì) 美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑小麥麩皮不溶性膳食纖維的制備 將黑小麥麩皮粉碎，稱取800 g麩皮，在121℃下進(jìn)行高壓蒸汽處理45 min。將處理過的黑小麥麩皮懸浮于6000 mL水中，加入耐溫α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶以去除淀粉和蛋白質(zhì)，高溫滅酶后，離心（3000 r/min，15 min），棄去上清液，沉淀依次用熱蒸餾水、無水乙醇洗滌，離心，將沉淀真空干燥，得到黑小麥麩皮不溶性膳食纖維［11］。

1.2.2 黑小麥阿魏酰低聚木糖的酶法制備工藝 稱取5 g不溶性膳食纖維置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液，添加木聚糖酶液，在不同pH、溫度條件下酶解不同時(shí)間。酶解結(jié)束后，100℃滅酶10 min，離心，取上清液檢測FOs含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以木聚糖酶添加量（5.0、7.5、10、12.5、15、17.5、20.0、22.5 mg/L）、酶解時(shí)間（6、12、18、24、30、36 h）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、酶解溫度（35、40、45、50、55℃）等4個(gè)因素做單因素實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，確定各因素適宜的范圍。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量及水平。根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以阿魏酰低聚木糖的濃度為指標(biāo)，選取木聚糖酶添加量、酶解時(shí)間、溫度、pH四個(gè)因素，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，用響應(yīng)面分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，來確定最佳工藝參數(shù)。

表1 因素水平編碼表Table1 The coding table of factors and levels

1.2.5 阿魏酰低聚木糖的含量測定 采用雙波長法測定FOs的濃度［12］。在MOPS緩沖液中（100 mmol/L，pH6.0）中進(jìn)行檢測，F(xiàn)Os濃度按如下公式計(jì)算。其中，ε286=14176 L·mol-1·cm-1，ε325=10350 L·mol-1·cm-1，ε′286=12465 L·mol-1·cm-1，ε′325=19345 L·mol-1·cm-1。

1.2.6 FOs組分分析 采用薄層層析法。展開劑：V乙酸乙酯∶V甲醇∶V蒸餾水∶V氨水=5∶9∶1∶1.5。顯色劑：苯胺－二苯胺－磷酸［13］。酶解液經(jīng)薄層層析后與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，對(duì)其進(jìn)行分析。

1.2.7 酶解液中阿魏酸的HPLC檢測 用乙酸乙酯萃取酶解液，重復(fù)萃取3次，合并并揮干其中的有機(jī)溶劑，用1 mL甲醇復(fù)溶，為酶解液中的游離態(tài)阿魏酸。萃取后的水相用2 mol/L NaOH酯解后，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，經(jīng)萃取復(fù)溶后得到結(jié)合態(tài)阿魏酸［1］。將游離態(tài)和結(jié)合態(tài)阿魏酸樣品進(jìn)行HPLC測定。

HPLC條件：C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-2%乙酸；梯度洗脫：0～10 min 0.5%→5.0%，10～20 min 5.0%→20.0%，20～40 min 20.0%→50.0%，40～48 min 50.0%→80.0%，48～55 min 80.0%→0.5%；柱溫為室溫；流速1.0 mL/min；檢測波長320 nm；進(jìn)樣量20 μL，與標(biāo)準(zhǔn)品阿魏酸峰保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，對(duì)酶解液中是否存在阿魏酸進(jìn)行鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Excel軟件進(jìn)行處理，分別計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，通過Origin 7.5軟件進(jìn)行繪圖，得到各因素對(duì)FOs濃度影響的折線誤差圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑小麥麩皮不溶性膳食纖維的制備

黑小麥麩皮經(jīng)121℃高壓蒸汽處理使其內(nèi)源性酶失活，經(jīng)耐溫α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶處理，去除麩皮中的淀粉和蛋白質(zhì)，制得416.12 g不溶性膳食纖維，得率為52%。

2.2 酶解麩皮制備阿魏酰低聚木糖的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 木聚糖酶添加量對(duì)FOs濃度的影響 木聚糖酶添加量對(duì)酶解液FOs濃度的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著木聚糖酶添加量的增加，F(xiàn)Os濃度變化趨勢是先增加后趨于平緩。這是因?yàn)榈孜餄舛纫欢?，在相同的時(shí)間內(nèi)，隨著酶量的增加，酶解效率提高，從水不溶性膳食纖維中釋放的FOs增多，使FOs濃度升高；當(dāng)?shù)孜镏写蟛糠諪Os被釋放出來后，即使酶量繼續(xù)增加，F(xiàn)Os濃度先上升后下降。結(jié)果表明，木聚糖酶添加量大于12.5 mg/L，F(xiàn)Os濃度上升很快，當(dāng)酶添加量達(dá)到17.5 mg/L時(shí)，F(xiàn)Os濃度較高，但從此時(shí)酶解液的薄層層析結(jié)果來看（如圖2），酶解液中聚合度為3～5的FOs含量開始減少；當(dāng)木聚糖酶添加量達(dá)到20 mg/L時(shí)，薄層層析結(jié)果顯示，酶解液中聚合度為3～5的FOs明顯減少。而木聚糖酶添加量為12.5 mg/L時(shí)，酶解液中FOs的濃度雖然沒有酶添加量為20 mg/L酶解液中FOs濃度高，但聚合度為3～5的FOs含量顯然比20 mg/L的酶解液中FOs含量多。結(jié)合FOs濃度變化及酶解液中低聚糖組成的變化，后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)揪厶敲柑砑恿看_定為12.5、15.0、17.5 mg/L三個(gè)水平。

圖1 木聚糖酶添加量對(duì)FOs濃度的影響Fig.1 Influence of xylanase amount on the concentration of FOs

圖2 不同木聚糖酶添加量酶解液的薄層層析Fig.2 TLC of hydrolyzate of different xylanase amount

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)FOs濃度的影響 酶解時(shí)間對(duì)酶解液FOs濃度的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，F(xiàn)Os濃度逐漸增大，在24 h時(shí)，F(xiàn)Os的濃度達(dá)到最高值0.434 mmol/L，此后隨著時(shí)間的延長，F(xiàn)Os濃度逐漸減小。這可能是因?yàn)樵谒嵝原h(huán)境下，隨著酶解時(shí)間的延長，原來的酶解產(chǎn)物FOs的阿魏酸基團(tuán)被酸解游離出來從而生成低聚木糖，導(dǎo)致FOs濃度下降。結(jié)果表明，酶解時(shí)間在18～30 h時(shí)，F(xiàn)Os濃度較大。因此，后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)酶解時(shí)間確定為18、24、30 h三個(gè)水平。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)FOs濃度的影響Fig.3 Influence of enzymolysis time on the concentration of FOs

2.2.3 pH對(duì)FOs濃度的影響 pH對(duì)酶解液FOs濃度的影響結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，F(xiàn)Os濃度的變化趨勢是先增加后減小，在pH5.0時(shí)FOs的濃度達(dá)到最高值0.465 mmol/L，這是因?yàn)閜H對(duì)木聚糖酶酶活的影響，在pH5.0的環(huán)境中酶活力較高。結(jié)果表明，pH在4.5～5.5時(shí)，酶活力較高，F(xiàn)Os濃度較高。因此，后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)pH確定為4.5、5.0、5.5三個(gè)水平。

圖4 pH對(duì)FOs濃度的影響Fig.4 Influence of pH value on the concentration of FOs

2.2.4 酶解溫度對(duì)FOs濃度的影響 酶解溫度對(duì)酶解液FOs濃度的影響結(jié)果如圖5所示，隨溫度的升高，F(xiàn)Os濃度的變化趨勢是先增大后減小，在45℃時(shí)達(dá)到最大值0.485 mmol/L。溫度對(duì)FOs濃度的影響主要因?yàn)閷?duì)酶活性的影響，即在35～45℃內(nèi)，酶的活力隨溫度的升高而升高，溫度升高加速了反應(yīng)體系中酶分子與底物的碰撞機(jī)會(huì)；溫度超過45℃時(shí)，酶的構(gòu)象和參與酶促反應(yīng)的功能團(tuán)發(fā)生了變化，酶活力下降，導(dǎo)致酶解液中FOs濃度降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶解溫度在40～50℃時(shí)，酶活力較高，F(xiàn)Os濃度較大。因此，后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)酶解溫度確定為40、45、50℃三個(gè)水平。

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果如表2所示。

圖5 溫度對(duì)FOs濃度的影響Fig.5 Influence of temperature on the concentration of FOs

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 The design and results of response surface experiments

2.3.2 方差分析與顯著性檢驗(yàn) 通過Design Expert數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行回歸分析，得到的方差分析結(jié)果如表3所示。由表3可知模型p值＜0.0001，該二次方程模型達(dá)到極顯著水平，決定系數(shù)R2為0.9688，說明響應(yīng)值FOs的濃度有96.88%來源于所選的自變量，模型失擬項(xiàng)p值為0.0736＞0.05，檢驗(yàn)不顯著，說明其他情況對(duì)模型干擾程度小，該響應(yīng)面回歸模型擬合度良好。在該模型中，對(duì)FOs濃度有顯著影響的有A、B、C、 D、AC、CD、A2、B2、C2及D2，該模型信噪比為20.077，該值大于4則表明該模型可以用于預(yù)測，該模型擬合優(yōu)度R2和調(diào)整R2分別為0.8307與0.9377，兩者的差值在可以接受的范圍內(nèi)。對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到以加酶量、酶解時(shí)間、溫度、pH為自變量的四元二次回歸方程：

表3 方差分析結(jié)果Table3 The results of variance analysis

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程的響應(yīng)曲面圖，見圖6～圖7。加酶量、酶解時(shí)間對(duì)FOs濃度的影響都極為顯著，坡度較陡，說明影響較大，酶解溫度和pH的曲線都比較平緩，說明影響較小。由圖6可知，加酶量和溫度交互作用顯著，隨著這兩個(gè)因素的增大FOs的濃度有明顯的增加。溫度和pH交互作用次之，當(dāng)溫度在（-0.5～0.5）水平，pH在（-0.5～0.5）水平上，F(xiàn)Os濃度有較為明顯的增加。

通過數(shù)據(jù)分析，酶法提取阿魏酰低聚木糖的最佳工藝條件為：加酶量15.48 mg/L，酶解時(shí)間22.20 h，溫度45.78℃，pH4.77，在此條件下FOs的濃度為0.4921 mmol/L?？紤]到可操作性，將條件調(diào)整為加酶量15.5 mg/L（930 U/mL），酶解時(shí)間22 h，溫度46℃，pH4.8。進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到FOs的濃度為0.4913 mmol/L，與理論值基本相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了回歸模型的可靠性，因此響應(yīng)面法對(duì)黑小麥麩皮阿魏酰低聚木糖的條件優(yōu)化是可行的。

圖6 加酶量和酶解溫度對(duì)FOs濃度的影響Fig.6 Influence of xylanase amount and temperature on the concentration of FOs

圖7 酶解溫度和pH值對(duì)FOs濃度的影響Fig.7 Influence of temperature and pH value on the concentration of FOs

2.4 薄層層析

圖8 酶解液FOs的薄層層析圖Fig.8 TLC of FOs in enzymatic hydrolyzate

酶解液FOs的薄層層析結(jié)果如圖8所示，圖8A中阿拉伯糖的位置低于木糖的位置，說明帶有阿拉伯糖基的低聚木糖薄層層析的遷移率會(huì)低于標(biāo)準(zhǔn)品低聚木糖。圖8B薄層層析結(jié)果顯示，酶解液中低聚木糖的遷移率都低于相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品低聚木糖的位置，說明酶解液中的低聚木糖含有阿拉伯糖基，是阿拉伯低聚木糖；且酯合的阿魏?；鶊F(tuán)會(huì)增加低聚木糖的相對(duì)分子質(zhì)量，也會(huì)導(dǎo)致阿魏酰低聚木糖的遷移率低于標(biāo)準(zhǔn)品低聚木糖。

2.5 酶解液中阿魏酸的HPLC檢測

采用HPLC對(duì)酶解液中的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)阿魏酸進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖9所示。圖9A為阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜，峰保留時(shí)間為28.796 min；與標(biāo)準(zhǔn)品阿魏酸的峰保留時(shí)間對(duì)比，圖9B和圖9C中均含有阿魏酸，分別為酶解液中游離態(tài)阿魏酸和結(jié)合態(tài)阿魏酸。比較圖9B和圖9C可以看出，酶解液中僅含有微量游離態(tài)阿魏酸，而大部分阿魏酸則是以結(jié)合態(tài)阿魏酸的形態(tài)存在，表明酶解液中的低聚糖是阿魏酰低聚木糖。

圖9 酶解液中阿魏酸的HPLC圖譜Fig.9 The HPLC chromatogram of ferulic acid in enzymatic hydrolyzate

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析，確定了木聚糖酶酶解黑小麥麩皮不溶性膳食纖維制備阿魏酰低聚木糖的最佳工藝參數(shù)為：加酶量15.5 mg/L（930 U/mL），反應(yīng)時(shí)間22 h，pH4.8，溫度46℃。在此優(yōu)化工藝條件下，F(xiàn)Os的濃度為0.4913 mmol/L。薄層層析和HPLC分析結(jié)果表明，酶解液中的低聚糖含有結(jié)合態(tài)阿魏酸，是阿魏酰低聚木糖。

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Optimization of enzymatic preparation of feruloylated oligosaccharides from black-grained wheat

YI Xin1，SUN Yuan-lin2，*，CHEN Shu-jun1，SHAN Fang3，LI Yun-long3，CUI Xiao-rui2
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Department of Life Science，Yuncheng University，Yuncheng 044000，China；3.Institute of Farm Products Comprehensive Utilization，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

The enzymatic preparation of feruloylated oligosaccharides from black-grained wheat was studied.The insoluble dietary fiber was then hydrolyzed by xylanase to release feruloylated oligosaccharides（FOs）.The content and composition of FOs were analyzed by HPLC，combining with dual-wavelength method and thin layer chromatography（TLC）.Based on the single factor experiments of enzyme dosage，reaction time，pH，and temperature，with FOs concentration as response value，the process for enzymatic production of FOs was optimized by using response surface methodology employing a four-level，three-variable central composition rotatable design.The optimum reaction conditions were as follows：preparing for 22 h at 46℃，with enzyme concentration of 15.5 mg/L and pH4.8.Under the conditions，F(xiàn)Os content of the product was 0.4913 mmol/L.The results of TLC and HPLC showed that the oligosaccharides of hydrolyzate containing conjugated ferulic acid which was feruloylated oligosaccharides.

black-grained wheat；feruloylated oligosaccharides；xylanase；optimization

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0191-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.031

2015－07－23

儀鑫（1991-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品資源綜合利用與開發(fā)，E-mail：15735172003@163.com。

孫元琳（1971-），女，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品資源綜合利用與開發(fā)，E-mail：sylwts@aliyun.com。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101244）；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012011031-1）；山西省高校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人支持計(jì)劃資金；山西省教育改革項(xiàng)目（J2014105）。