兔蛛網膜下腔出血后基底動脈平滑肌細胞的分離方法研究*

鄭麗蓉,施賢清

(1.貴陽醫學院研究生學院,貴陽 550004;2.貴州省人民醫院重癥醫學科，貴陽 550002)

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兔蛛網膜下腔出血后基底動脈平滑肌細胞的分離方法研究*

鄭麗蓉1,施賢清2△

(1.貴陽醫學院研究生學院,貴陽 550004;2.貴州省人民醫院重癥醫學科，貴陽 550002)

目的建立一種快速、有效的分離兔蛛網膜下腔出血(SAH)后基底動脈平滑肌細胞(BASMCs)的方法。方法采用木瓜蛋白酶、二硫赤蘚糖醇(DTE)、膠原酶(Ⅺ型)兩步法急性分離兔SAH后BASMCs。利用倒置顯微鏡觀察細胞數量及形態，臺盼藍法測定BASMCs成活率。結果分離出BASMCs的數量(40.33±10.18)個/200倍視野，鏡下觀察絕大多數平滑肌細胞呈長梭形，包膜完整光滑，細胞成活率為80%。結論該方法能快速、有效地分離BASMCs,并獲得足夠數量的細胞，為SAH后腦血管痙攣(CVS)BASMCs上離子通道的膜片鉗研究創建了條件。

兔；蛛網膜下腔出血；基底動脈平滑肌細胞；分離方法

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)后腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)的發病率高達30%～90%，是導致患者高傷殘率和高病死率的主要原因之一[1]。隨著電生理技術的發展，膜片鉗逐漸運用于CVS發生機制中離子通道的研究，而獲取單個理想的基底動脈平滑肌細胞(basilar artery smooth muscle cells,BASMCs)對單細胞膜片鉗研究極為重要[2-5]。本實驗觀察木瓜蛋白酶、二硫赤蘚糖醇(DTE)、膠原酶(Ⅺ型)兩步酶消化法能否快速有效地分離BASMCs，從而為單細胞膜片鉗研究創造條件。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物新西蘭大白兔，體質量2.5～3.0 kg，雌雄不拘，由四川大學華西基礎醫學院動物中心提供。

1.1.2主要實驗儀器倒置顯微鏡(OLYMPUS，型號IX70)；解剖顯微鏡(Olympus,型號SZX7)；恒溫水浴箱(ATAGO，型號60-C4)；電子天平(流陽龍騰電子稱量儀器有限公司，型號ESJ120-4)。

1.1.3實驗試劑和配置方法木瓜蛋白酶、DTE、膠原酶(Ⅺ型)均購自SIGMA。生理鹽溶液(PSS液)成分：NaCl 140 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，MgCl21.3 mmol/L，Hepes 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用NaOH調溶液pH為7.4。灌流液成分：NaCl 125 mmol/L，BaCl210 mmol/L，Hepes 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，TEA-Cl 4 mmol/L，MgCl21 mmol/L，用NaOH 調溶液pH為7.3。酶溶液Ⅰ：1 mL PSS液中加入0.3 mg/mL木瓜蛋白酶和1 mg/mL DTE。酶溶液Ⅱ：1 mL PSS液中加入1 mg/mL膠原酶(Ⅺ型)。PSS、灌流液配置后4 ℃保存備用，酶溶液Ⅰ、酶溶液Ⅱ配置后-20 ℃保存備用。

1.2方法

1.2.1SAH模型制作通過枕大池注入非抗凝自體動脈血復制SAH模型[6]，具體步驟如下：麻醉后馬上使兔俯臥頭低位固定在動物實驗臺上，用頭皮針經枕骨下間隙輕輕刺入，有突破感后見清亮腦脊液流出，然后取耳中動脈非抗凝血按1 mL/kg注入,局部按壓1 min，注射完后取30°頭低位30 min，然后側臥位觀察，待自然蘇醒抬頭后放入兔籠，完全蘇醒后送回動物飼養室觀察,給予正常喂養。

1.2.2取材[7-8]正常喂養48 h后，3%戊巴比妥鈉麻醉后迅速斷頭取出腦組織，放在4 ℃、在充予95%O2/5%CO2混合氣體的PSS液中分離基底動脈，并在解剖顯微鏡下剪去小的血管分支和清除其周圍組織，縱向切開血管，清洗掉血紅蛋白，刮除血管內皮，將血管剪成細塊狀。

1.2.3BASMCs的分離按下列步驟進行酶消化：先將基底動脈移入酶溶液Ⅰ中并放在37 ℃恒溫水浴箱中消化20 min，移去酶溶液Ⅰ，加入酶溶液Ⅱ并放在37 ℃恒溫水浴箱中繼續消化30 min，然后終止消化，用4 ℃的PSS液沖洗3次，最后用尖端鈍的吸管反復吹打直到有足夠數量的單個血管平滑肌細胞釋放出來。分離好的細胞懸液置4 ℃冰箱保存。

1.2.4細胞數量、形態學觀察及細胞成活率檢測吸取適量BASMCs溶液在倒置顯微鏡下觀察平滑肌細胞形態。吸取0.4 mL BASMCs溶液,加入0.1 mL 0.4%臺盼藍染液,吹打混勻,室溫下染色3～5 min,吸取適量在顯微鏡下觀察細胞計數。計算細胞存活率：存活率=(細胞總數-死細胞數)/細胞總數×100%。

2　結　　果

2.1SAH模型注血后，兔出現煩躁，呼吸、心率加快，麻醉蘇醒后精神萎靡、嗜睡，飲水及進食減少，體質量減輕。斷頭開顱取腦組織，見兔后顱窩各腦池內殘留大小不等的暗紅色血凝塊，以基底池較重，周圍蛛網膜部分粘連，見圖1。

2.2細胞數量、形態觀察及細胞成活率檢測分離出BASMCs數量(40.33±10.18)個/200倍視野，在倒置相差顯微鏡下絕大多數呈長梭形或橢圓形，長梭形的平滑肌細胞數量最多，胞膜完整、光滑、折光度高、胞質均勻，見圖2。健康的正常細胞能夠排斥臺盼藍，而死亡的細胞膜的完整性喪失，通透性增加，可被臺盼藍染成藍色。顯微鏡下計數300個平滑肌細胞，80%以上的細胞胞質未被染色，細胞存活率80%以上，見圖3。

圖1 枕大池內血凝塊圖2 BASMCs光鏡照片(×200)圖3 BASMCs臺酚藍染色(×200)

3　討　　論

實體組織材料的細胞分離常用方法有機械分散法、酶消化分離法和細胞培養。機械分散法僅適用于處理纖維成分少的軟組織，此法雖然簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差。由于兔基底動脈纖維成分相對較多，管徑細小，單純的機械分散法不足以高效的分離BASMCs。而細胞培養耗時長，受生長過程中的多因素影響，較難滿足膜片鉗的需要[9-11]。本實驗采用木瓜蛋白酶、DTE、膠原酶(Ⅺ型)兩步酶消化，膠原酶(Ⅸ型)適用于消化纖維多的組織，分離效果較好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PSS和含血清的培養液配制，即操作簡便又可提高細胞成活率。通常，傳統的單一膠原酶消化法存在著明顯的不足，組織經過膠原酶處理后會釋放出大量的膠原蛋白，膠原蛋白呈絮狀，使上清很難分離開，妨礙細胞從組織中釋放出來，而木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，將肌纖維組織中連接的細胞外基質解離，使細胞更容易游離出組織。

影響分離細胞成功率的關鍵因素包括消化酶的種類及濃度、消化的時間、環境的溫度、pH、血管的來源和實驗動物的種屬及狀態等諸多因素。在消化過程中,酶消化時間太短時,組織沒有被分解，細胞分離數目不多；而消化時間過長,易損傷膜表面的蛋白質,使細胞產生破損，所有消化酶的用量和時間較難掌握，很難判斷消化的程度是否達到需要，需探索最適宜酶濃度及酶解時間，并保證酶的最佳活性溫度及最適pH值[4-5，8，12]。本實驗聯合使用膠原酶(Ⅸ型)和木瓜蛋白酶，并在酶解液中加入DTE，用以保護細胞，經多次探索發現在含木瓜蛋白酶0.3 mg/mL 37 ℃水浴消化20 min、膠原酶(Ⅺ型)1 mg/mL 37 ℃水浴消化30 min，酶解液pH 7.3，能防止酶解過度或不全的情況發生。

操作過程注意事項[2,9,12-15]：由于基底動脈平滑肌對各種機械和理化刺激十分敏感，故在分離血管的過程中動作一定要輕柔，避免機械牽拉血管，可在解剖顯微鏡下取材。分離血管和細胞的液體最好新鮮配制，或配好后分裝，放置在-20 ℃冰箱內保存,使用前再調一次pH值，以確保pH值在7.2～7.4。在分離血管的整個過程中將腦組織置于4 ℃的PSS溶液中，可降低整個腦組織的代謝，從而保護血管組織活性。另外，在分離過程中溶液始終要充氧，對細胞有保護作用。本實驗所采取的急性酶解法能成功得到單個的BASMC,數量滿意，自血管分離到消化成單個細胞的整個過程大約只需60 min，而且消化后所得到的單個血管平滑肌細胞狀態良好,存活率高，為SAH后CVS的BASMCs上離子通道的電研究提供了理想的單個平滑肌細胞。

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Isolation of smooth muscle cells from rabbit basilar artery after subarachnoid hemorrhage*

Zheng Lirong1,Shi Xianqing2△

(1.Graduate School,Guiyang Medical University，Guiyang,Guizhou 550004,China;2.Department of Intensive Care Unit,GuiZhouProvincial People′s Hospital,Guiyang,Guizhou 550002,China)

ObjectiveTo establish a fast and efficient method to isolate basilar artery smooth muscle cells (BASMCs) form rabbit after subarachnoid hemorrhage (SAH).MethodsSingle BASMCs were obtained by sequential two-step enzyme digestion with papain,DTE and collagenase type Ⅺ.The cell count and cellular morphology were observed by inverted microscope.The survival ratio was measured by trypan blue method.ResultsThe number of isolated smooth muscle cells was 40.33±10.18 per 200 times of field of vision.Under the microscope,most smooth muscle cells showed a long spindle shape,the film was smooth,and the survival rate was 80%.ConclusionThe method can separate BASMCs rapidly and effectively,and obtain a sufficient number of cells,it may be provide enough cells for the research of ion channels on BASMCs with cerebral vasospasm (CVS) after SAH.

rabbit；subarachnoid hemorrhage;basilar artery smooth muscle cells;isolation method

貴州省科學技術基金項目(黔科合J字[2010]2155號)。作者簡介：鄭麗蓉(1988-)，住院醫師，碩士，主要從事腦保護研究。△

，E-mail:364888849@qq.com。

·技術與方法·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.028

R743.35

A

1671-8348(2016)22-3107-02

2016-02-12

2016-03-15)