口腔白斑和鱗狀細(xì)胞癌中人乳頭瘤病毒感染分析

陳　亮，黃曉峰，郭　平，吳非非

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院口腔科，安徽蕪湖 241001;2.南京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院/南京市口腔醫(yī)院病理科，江蘇南京210008)

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口腔白斑和鱗狀細(xì)胞癌中人乳頭瘤病毒感染分析

陳亮1，黃曉峰2，郭平1，吳非非1

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院口腔科，安徽蕪湖 241001;2.南京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院/南京市口腔醫(yī)院病理科，江蘇南京210008)

目的探討人乳頭瘤病毒(HPV)16/18感染與口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)臨床病理特征間的關(guān)系。方法原位雜交(ISH)和免疫組織化學(xué)(IHC)分別檢測(cè)10例正常口腔黏膜，26例口腔白斑(OLK)和56例OSCC中的HPV16/18水平，分析不同組間HPV16/18陽(yáng)性率間的差異和OSCC中HPV16/18感染與性別、年齡、TNM分期、組織學(xué)分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、吸煙的關(guān)系。結(jié)果ISH和IHC檢測(cè)HPV16/18陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)；OSCC和OLK患者中HPV16/18陽(yáng)性率高于正常口腔黏膜(P<0.05)；OSCC中吸煙者HPV16/18陽(yáng)性率明顯高于非吸煙者(P<0.05)。結(jié)論HPV16/18感染是部分OSCC的發(fā)病因素,其與吸煙對(duì)OSCC發(fā)病具有協(xié)同作用。

腫瘤，鱗狀細(xì)胞；白斑，口腔；口腔腫瘤；原位雜交；人乳頭瘤病毒

口腔白斑(oral leukoplakia,OLK)是目前公認(rèn)的口腔黏膜癌前病變，口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是具有不同程度鱗狀分化的侵襲性、上皮性的惡性腫瘤，在口腔頜面部惡性腫瘤中居于首位。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一種特異感染人類上皮黏膜的環(huán)狀DNA病毒，目前研究發(fā)現(xiàn)其感染也是部分口腔癌的致病因素，其中HPV16/18是具有高度致癌潛能的基因型。因此，本研究采用兩種檢測(cè)方法探討OLK、OSCC中HPV16/18表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料收集南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京市口腔醫(yī)院病理科56例患者的病理確診且臨床病理資料完整的OSCC標(biāo)本，其中男29例，女27例；年齡30～82歲，平均58歲，0～<58歲24例，≥58歲32例； TNM分期(2002年UICC標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ期13例，Ⅱ期14例，Ⅲ期8例，Ⅳ期21例；分化程度：高分化21例，中分化26例，低分化9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；非吸煙者36例，吸煙者20例。同時(shí)，收集同科室26份OLK標(biāo)本，10份黏液囊腫邊緣黏膜組織(檢測(cè)為正常口腔黏膜)。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)材料用于原位雜交(ISH)的HPV16/18 特異性探針和免疫組織化學(xué)(IHC)HPV16/18兔抗人單克隆抗體即用型工作液均購(gòu)于福州泰普生物科學(xué)有限公司。通用型EnVision IHC試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、抗原修復(fù)液乙二胺四乙酸(EDTA)均為丹麥Dako公司產(chǎn)品。

1.2.2主要操作步驟10例正常口腔黏膜，26例OLK，56例OSCC標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，然后常規(guī)脫水，石蠟包埋和4 μm連續(xù)切片，最后經(jīng)脫蠟及水化。IHC EnVision法主要步驟：標(biāo)本切片經(jīng)高溫和高壓抗原修復(fù)，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育30 min，最后經(jīng)DAB法顯色。ISH法主要操作步驟：標(biāo)本切片微波雜交預(yù)處理，特異性探針雜交，信號(hào)放大，最后經(jīng)組織細(xì)胞原位DAB法顯色。

1.2.3結(jié)果判斷探針和一抗采用PBS代替做出的試驗(yàn)結(jié)果作為HPV16/18陰性對(duì)照，已知HPV16/18陽(yáng)性的尖銳濕疣作為陽(yáng)性對(duì)照。IHC法檢測(cè)：標(biāo)本細(xì)胞核呈棕黃色團(tuán)塊樣或彌漫性顆粒為HPV抗原(+)，反之為HPV抗原(-)。ISH法檢測(cè)時(shí)標(biāo)本細(xì)胞核呈棕褐色團(tuán)塊樣或彌漫顆粒著色為HPV-DNA(+)，反之為HPV-DNA(-)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1IHC、ISH法檢測(cè)各組標(biāo)本中HPV16/18的陽(yáng)性率IHC法陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色團(tuán)塊樣或彌漫性顆粒著色(圖1、2)，而ISH法陽(yáng)性細(xì)胞核呈清晰的棕褐色團(tuán)塊樣或彌漫顆粒著色(圖3、4)。兩種檢測(cè)方法相比，ISH法檢測(cè)結(jié)果鏡下觀察背景清晰，對(duì)比度強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞并非都是挖空細(xì)胞。IHC、ISH兩種檢測(cè)方法檢測(cè)所選標(biāo)本HPV16/18陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HPV16/18感染率在OLK和OSCC間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在OLK和OSCC中顯著高于正常口腔黏膜(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖5。

表1　正常口腔黏膜、OLK、OSCC中HPV16/18的陽(yáng)性表達(dá)(n)

圖1　OLK中HPV16/18抗原(+)表達(dá)(IHC，×400)

圖2　OSCC中HPV16/18抗原(+)表達(dá)(IHC，×400)

2.2HPV16/18陽(yáng)性率與OSCC患者臨床病理特征間的相關(guān)性HPV16/18陽(yáng)性率與患者的性別、年齡、臨床TNM分期、組織學(xué)分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)(P>0.05)，而在吸煙患者標(biāo)本中HPV16/18陽(yáng)性率顯著高于非吸煙患者(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖3　OLK中HPV16/18-DNA(+)表達(dá)(ISH，×400)

圖4　OSCC中HPV16/18-DNA(+)表達(dá)(ISH，×400)

圖5　ISH、免疫組織化學(xué)檢測(cè)HPV16/18的陽(yáng)性率

表2　HPV16/18陽(yáng)性數(shù)與口腔鱗癌臨床病理特征間的相關(guān)性

續(xù)表2　HPV16/18陽(yáng)性數(shù)與口腔鱗癌臨床病理特征間的相關(guān)性

3　討　　論

OSCC呈侵襲性生長(zhǎng)，是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占90%，全球每年新增口腔癌病例近3萬(wàn)例[1]，主要致病因素包括煙酒、咀嚼檳榔、殘根殘冠及化學(xué)和生物刺激等。癌前病變中的OLK是以上皮異常增生為主要病理改變的一種黏膜病，癌變率為3%～5%。高危型HPV16/18可引起上皮的惡性腫瘤，最常見(jiàn)的是子宮頸癌，此外還是部分口腔癌[2-3]和口咽癌的主要致病因素[4-5]。

目前雖然有多種檢測(cè)HPV感染的方法，但因材料、試驗(yàn)條件、判讀標(biāo)準(zhǔn)等差異，同一組標(biāo)本HPV陽(yáng)性率存在差異。IHC利用抗體檢測(cè)標(biāo)本中HPV-Ag的水平，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、能定位，缺點(diǎn)是抗體針對(duì)衣殼蛋白常在復(fù)制晚期出現(xiàn)，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的低敏性和假陰性；ISH利用特異性探針與標(biāo)本的HPV-DNA進(jìn)行雜交，具有高靈敏和特異性，是比較理想的檢測(cè)法，但常受到標(biāo)本中HPV-DNA數(shù)量的影響[6-7]。本研究采用上述兩種檢測(cè)法分別對(duì)所選標(biāo)本行HPV16/18檢測(cè)，結(jié)果顯示二者檢測(cè)出的HPV16/18陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但I(xiàn)SH法檢測(cè)HPV16/18陽(yáng)性的標(biāo)本顯微鏡下較清晰。

研究HPV16/18感染與口腔鱗癌、癌前病變及正常黏膜的相關(guān)性，回顧文獻(xiàn)可發(fā)現(xiàn)HPV16/18感染與口腔黏膜癌、OLK密切相關(guān)。Miller等[8]采用了Meta分析對(duì)1982～1997年間發(fā)表于Medline上有關(guān)HPV與口腔癌關(guān)系的文章進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示口腔癌感染HPV的合并優(yōu)勢(shì)比是正常黏膜的5.37倍。Mattila等[9]在15.9%的OLK中檢測(cè)到HPV，而Syrj?nen等[10]在29%的OLK中檢測(cè)出HPV。本研究OSCC和OLK中HPV16/18陽(yáng)性率明顯高于正常黏膜，結(jié)果與之前研究相一致[8-10]，提示HPV16/18感染可能是OSCC或是癌前病變的致病因素之一。但HPV感染和口腔黏膜癌變間的因果關(guān)系目前仍無(wú)法解釋，其具體機(jī)制有待研究。

長(zhǎng)久以來(lái)，煙酒被認(rèn)為是OSCC的首要危險(xiǎn)因素，但有近10%～20%的病例無(wú)煙酒史，這類腫瘤發(fā)病機(jī)制可能與病毒感染有關(guān)[11]。本研究分析HPV感染與OSCC臨床資料(包含年齡、性別、腫瘤臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及吸煙史)間的相關(guān)性，結(jié)果顯示HPV感染僅與患者是否吸煙有關(guān)，提示吸煙與HPV感染對(duì)口腔癌的發(fā)生具有協(xié)同作用，與Schwartz等[12]研究相一致，但也有研究未發(fā)現(xiàn)二者有協(xié)同作用[13-14]。因此，二者在OSCC中的具體關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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Human papillomavirus infection in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma

Chen Liang1,Huang Xiaofeng2,Guo Ping1,Wu Feifei1

(1.Department of Stomatology,Yijishan Hospital,the First of Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu,Anhui 241001,China;2.Department of Pathology,School of Stomatology,Nanjing University/ Nanjing Stomatological Hospital,Nanjing,Jiangsu 210008,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between HPV16/18 infection and the clinicopathological characteristics of oral squamous cell carcinoma (OSCC).MethodsHPV16/18 was detected by the situ hybridization (ISH) and immunohistochemical (IHC) in 10 cases of normal oral mucosa,26 cases of oral leukoplakia (OLK) and 56 cases of oral squamous cell carcinoma (OSCC).We analysed the difference of the HPV16/18 positive rate among groups,and explored the correlation between HPV infection and the gender,age,TNM staging,histological garde,lymph node metastasis and smoking in OSCC patients.ResultsThere was no significant difference between ISH and IHC in detecting HPV16/18 positive rate (P>0.05).The HPV16/18 positive rates in patients of OLK and OSCC were significantly higher than that in normal oral mucosa patients(P<0.05).The HPV16/18 positive rate in smokers was significantly higher than that in non-smokers of OSCC(P<0.05).ConclusionHPV16/18 infection is considered to be a pathogenic factor in OSCC.HPV16/18 infection and smoking have a synergistic effect on the pathogenesis of OSCC.

neoplasms,squamous cell；leukoplakia,oral；mouth neoplasms；in situ hybridization；human papillomavirus

陳亮(1983-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事口腔頜面部腫瘤方面研究。

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.022

R780.2

A

1671-8348(2016)22-3086-03

2016-02-08

2016-05-11)