慢性心房顫動降低 Junctophilin-2在心房中的表達研究*

李妙齡，歐賢紅，李　濤，毛　亮，楊　艷，曾曉榮

(西南醫科大學心血管醫學研究所，四川瀘州 646000)

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慢性心房顫動降低 Junctophilin-2在心房中的表達研究*

李妙齡，歐賢紅，李濤，毛亮，楊艷，曾曉榮△

(西南醫科大學心血管醫學研究所，四川瀘州 646000)

目的明確在慢性心房顫動(AF)中Junctophilin-2(JPH2)表達變化及意義。方法從心臟外科體外循環手術中獲取21例竇性心律(SR)患者和30例慢性AF患者右心房肌組織，采用免疫組織化學方法測定心房肌組織JPH2蛋白的分布；實時熒光定量PCR法檢測心房肌JPH2 mRNA水平；Western blot測定人心房肌JPH2蛋白水平。結果免疫組織化學實驗發現SR組與AF組心房肌組織上均存在JPH2蛋白表達，SR組著色更明顯；AF組心房肌JPH2 mRNA水平和蛋白水平均明顯低于SR組(P<0.01)。結論慢性AF患者心房肌JPH2的表達下調可能與心房肌細胞內鈣紊亂密切相關。

心房顫動；心房；鈣；Junctophilin-2

心房顫動(atrial fibrillation,AF)是臨床最為常見的持續性心律失常，有較高的發病率和致死率，臨床治療效果欠佳，藥物治療還可增加室性心律失常的發生率[1]。細胞內鈣處理異常被認為是心房功能紊亂的最主要原因[2]。Junctophilins(JPHs)是新近發現存在細胞膜L型鈣通道(LTCC)與肌漿網RyR2間的膜耦聯復合物，是可興奮細胞參與細胞內鈣信號轉導的重要亞細胞結構[3]。JPHs包括4種亞型JPH1、JPH2、JPH3和JPH4，心肌上主要表達JPH2。有研究發現小鼠心臟JPH2基因沉默可導致肌漿網鈣泄漏而致心力衰竭[4]，而在AF心肌中JPH2會發生怎樣的改變，目前還不清楚。

1　資料與方法

1.1一般資料所取標本來源于2013年3～11月本院胸心外科體外循環手術患者右心房肌組織，包括竇性心律(SR)21例和慢性AF患者30例，術前所有患者均簽署了知情同意書，并獲得醫院倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學取SR組5例和AF組5例患者右心房組織用于免疫組織化學染色。標本從術中取回后經10%福爾馬林固定后制作蠟塊后切片，給予JPH2 一抗(Abcam公司,1∶200)孵育過夜，二抗(HRP 1∶2 000)孵育30 min。應用二氨基聯苯胺顯色，并在顯微鏡下觀察，顯色后5 min，復染再脫水，用中性樹膠封片。細胞膜和胞質呈現二氨基聯苯胺棕黃色著色為表達陽性。

1.2.2實時熒光定量PCR法測定人心房JPH2 mRNA表達水平JPH2：上游引物5′-CTT TGA GGT GGC AGG TGT CTA-3′,下游引物5′-ATT CCG TAG CGT CCC TTG A-3′； β-actin：上游引物5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG-3′，下游引物 5′-TGT CAC GCA CGA TTT CC-3′。Trizol法提取心房肌總RNA，采用ReverTra-Plus擴增試劑盒從1 μg總RNA中逆轉錄合成cDNA，所得cDNA以SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO) 進行擴增，以β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.3Western blot檢測JPH2蛋白水平將心臟手術中取回的心房肌標本于PBS液中去除血液，剪去結締組織及脂肪組織后，放入預先標記好的EP管中于-80 ℃凍存備用。收集齊標本后(SR組16例，AF組25例)于冰上凍融并剪成小塊(1 mm ×1 mm ×1 mm),加入裂解液20 mg/100 μL間斷勻漿2 min，至無明顯顆粒后，在超聲波下處理3次，每次10 s。隨后于冰上裂解30 min，再以10 000 r/min 4 ℃條件下離心10 min取上清液。取少量上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒按使用說明測定蛋白質濃度。以每孔25 μg蛋白量進行SDS-PAGE電泳，先以80 V電容40 min，再以100 V電泳120 min，電泳完成后再轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經5%脫脂奶粉封閉1 h后，用JPH2一抗(Abcam 1∶500)和GAPDH一抗(1∶2 000)孵育過夜，隔日用辣根過氧化酶標記的二抗(1∶10 000)孵育，采用化學熒光(羅氏)顯影。

2　結　　果

2.1臨床資料特征持續性AF患者持續時間均大于6個月。AF組左房直徑明顯大于SR組，心功能Ⅳ級患者多于SR組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2免疫組織化學法測定JPH2在人心房中的分布SR組心肌排列明顯比AF組有規律，呈條索狀排列；從組織著色可以看出SR組和AF組心房肌上均存在JPH2的表達，且SR組患者的棕黃色顆粒明顯多于AF組。見圖1。

2.3兩組心房肌JPH2 mRNA水平根據圖像成像掃描，在196 bp和142 bp處分別觀察到JPH2和β-actin擴增引物，以SR組與AF組心房肌JPH2/β-actin的比值為1.00±0.21 vs.0.38±0.04(P<0.01)，經統計分析表明AF組心房肌JPH2 mRNA表達水平比SR組明顯降低了(61.9±3.6)%。

2.4兩組心房肌JPH2蛋白水平根據顯影灰度值定量分析JPH2與GAPDH比值，經統計SR組與AF組的比值為1.35±0.38 vs.0.62±0.21(P<0.01)。結果顯示與SR組相比，AF組JPH2降低了(54.2±4.61)%。見圖2。

表1　患者資料

*：P<0.05,△：P<0.01，與SR組比較。

A:SR組(×200);B:AF組(×200);C:SR組(×400);D:AF組(×400)。

圖1人心房肌JPH2免疫組織化學染色結果

A:JPH2蛋白印跡原始圖;B:標準化的JPH2蛋白的表達水平。

圖2兩組心房肌JPH2蛋白水平

3　討　　論

本實驗結果表明，JPH2均廣泛分布于SR和慢性AF患者心房肌組織中。與SR患者相比，從組織水平、基因和蛋白水平均證明了慢性AF患者心房肌JPH2表達明顯下調，表明AF改變了JPH2的正常功能，可能參與了AF的發生和維持。

JPHs是新近發現存在于可興奮細胞膜與肌漿網之間的膜耦聯蛋白，使二者保持在一個較近的距離[4]，有利于細胞膜與肌質膜之間的信號轉導，在興奮-收縮耦聯過程中發揮重要作用。JPHs在哺乳動物中有多種亞型分布，JPH2主要分布在心肌上，JPH2位于細胞膜L型鈣通道與肌漿網RyR間的連接蛋白，對細胞內鈣穩態調控中發揮重要作用[5-6]。在生理狀態下，JPH2在心肌超微結構形成和對心臟負荷的反應中起到重要保障作用。JPH2功能調節異常與多種心血管疾病相關，目前對于JPH2功能異常對心臟的損害主要集中在心肌肥大及與心力衰竭的相關性研究。研究發現心肌肥大可引起JPH2表達下調，同樣心肌JPH2基因沉默可降低心肌興奮-收縮耦聯和細胞內鈣穩態[7]。JPH2過表達不能增強其基本功能，但能緩解向心力衰竭的發展[8]。在心力衰竭心肌細胞上[9]，心臟負荷可導致JPH2的轉運異常，JPH2失去在T管/Z線區域的正常定位，導致其在細胞膜上的重新分布。

不正常的細胞內鈣處理在心房顫動的發生與維持中發揮重要作用。本研究中發現JPH2在AF時明顯下調，這表明AF使JPH2 功能下調，心房肌興奮-收縮脫耦聯，興奮收縮偶聯效率降低，細胞內鈣調節紊亂，進而影響心房肌的收縮功能。有研究發現[10]，JPH2突變E169K可導致陣發性AF或室上性心動過速的發生，可能與其損害細胞內鈣調節相關。進一步研究發現在HL-1細胞上[11]，JPH2突變S101R,Y141H或S165F使細胞自發性鈣釋放的幅度和頻率均明顯降低。舒張期肌漿網鈣泄漏是AF的重要病理機制之一。研究發現[10]，降低JPH2表達可通過直接增加RyR2開放概率和間接降低鈉鈣交換體活性，進而增加肌漿網鈣泄漏，促進心力衰竭的發展。這也間接表明AF時JPH2表達下調可能通過增加鈣泄漏而促進AF的發展。

最新研究發現[10]，JPH2錯義突變降低了JPH2與RyR2間的結合比率，使RyR2功能受損導致舒張期肌漿網鈣泄漏和房性心律失常，這表明了JPH2可能是治療AF的潛在靶點。與此同時在同一期雜志上另有課題組也證明JPH2在穩定RyR2功能中發揮重大作用，也同時證明了JPH2功能異常參與了AF鈣泄漏過程。本結果也支持了JPH2表達下調參與了AF病理生理機制的調節，為探索AF的潛在治療靶點提供理論依據。

[1]European Heart Rhythm A,European Association for Cardio-Thoracic S,Camm AJ,et al.Guidelines for the management of atrial fibrillation:The task force for the management of atrial fibrillation of the european society of cardiology(esc)[J].Eur Heart J,2010,31(19):2369-2429.

[2]Wakili R,Yeh YH,Yan Qi,et al.Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs[J].Cir Arrh Electrophysiol,2010,3(6):530-541.

[3]Nishi M,Mizushima A,Nakagawara K,et al.Characterization of human junctophilin subtype genes[J].Bioc Biophysical Res Commu,2000,273(10):920-927.

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[8]Guo A,Zhang X,Iyer VR,et al.Overexpression of junctophilin-2 does not enhance baseline function but attenuates heart failure development after cardiac stress[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(20):12240-12245.

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Down-regulation of Junctophilin-2 in human atrial from patients with chronic atrial fibrillation*

Li Miaoling,Ou Xianhong,Li Tao,Mao Liang,Yang Yan,Zeng Xiaorong△

(Institute of Cardiovascular Research,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo cxplore the change and significance of Junctophilin-2(JPH2) expression in chronic atrial fibrillation(CAF).MethodsRight atrial muscle tissue of 21 patients with sinus rhythm (SR) and 30 patients with chronic atrial fibrillation (AF) were obtained from cardiopulmonary bypass surgery.The distribution of JPH2 in human atrial was assayed by immunohistochemistry technique;mRNA expression level was measured by the qRT-PCR,and the protein expression level of JPH2 was determined using Western blot analysis.ResultsImmunohistochemistry experiments found that the expression of JPH2 protein was found in right atrial muscle tissue of SR group and AF group,SR group staining was more obvious;JPH2 mRNA levels and protein levels were significantly lower in group AF than in SR group(P<0.01).ConclusionJPH2 is widely distributed in atrial muscle cells of SR group and AF group,the expression of JPH2 in patients with CAF may be closely related to the atrial myocytes calcium disorder.

atrial fibrillation;heart atria;calcium;Junctophilin-2

國家自然科學基金資助項目(81470022)；瀘州市-瀘州醫學院聯合項目(2013LZLY-J23)。作者簡介：李妙齡(1972-)，副研究員，碩士，主要從事心律失常發病機制研究。△

，E-mail:lyxjd7151@163.com。

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.008

R541.7

A

1671-8348(2016)22-3046-03

2016-03-15

2016-04-18)