乙醛對人腎小管上皮細胞合成分泌TGF-β1的影響研究

張林霞，李曉東

(河北省唐山市工人醫院：1.老年病三科；2.腎內科　063000)

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乙醛對人腎小管上皮細胞合成分泌TGF-β1的影響研究

張林霞1，李曉東2△

(河北省唐山市工人醫院：1.老年病三科；2.腎內科063000)

目的通過研究乙醛對體外培養的人腎小管上皮細胞合成分泌轉化生長因子-β1(TGF-β1)的影響，以探討乙醛導致腎小管間質纖維化的機制。方法選取人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)培養于含5%胎牛血清的DMEM/F12培養液中。以不同濃度的乙醛(0、50、100、200、400 μmol/L)刺激HK-2細胞24 h。逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測HK-2細胞中TGF-β1的基因表達；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中TGF-β1的蛋白表達。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測細胞培養上清液中TGF-β1的水平。結果RT-PCR和Western blot結果顯示，乙醛呈劑量依賴性地增加HK-2細胞中TGF-β1基因和蛋白的表達；ELISA法結果顯示，乙醛呈劑量依賴性地增加HK-2細胞培養上清液中TGF-β1的水平。結論乙醛能夠促進體外培養的人腎小管上皮細胞合成分泌TGF-β1，從而促進腎小管間質纖維化的進展。

乙醛；腎小管上皮細胞；轉化生長因子-β1；腎小管間質纖維化

眾所周知，長期大量飲酒會導致肝臟損害，嚴重時可造成酒精性肝硬化。機體攝入大量的乙醇后，約90%在肝臟乙醇脫氫酶的作用下轉化為乙醛，并進入血液循環。腎臟是僅次于肝臟的乙醇排泄器官。乙醇及其代謝產物通過腎臟排泄到尿中，尿中乙醇及代謝產物的水平高于肝臟及血液中的水平[1]。因此，長期過量飲酒也可導致乙醇性腎損害[2]。動物實驗表明，乙醇性腎損傷病理表現為腎小管間質的炎癥改變及纖維化[3]，但其作用機制目前尚不清楚。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是目前公認的促進腎小管間質纖維化的關鍵性的細胞因子[4]。本實驗通過研究乙醇的代謝產物乙醛對體外培養的人腎小管上皮細胞合成分泌TGF-β1的影響，為明確乙醇導致腎小管間質纖維化的發病機制提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞株)由唐山市工人醫院中心實驗室保存。乙醛購自天津鼎盛鑫化工有限公司，逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒為美國Promega公司產品，PCR引物由上海生工合成。兔抗人TGF-β1多克隆抗體、小鼠抗人Tubulin單克隆抗體購自美國Santa Cruze公司。堿性磷酶標記山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋公司，BCIP/NBP顯色試劑盒購自上海碧云天。TGF-β1ELISA試劑盒購自美國R & D公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養將HK-2細胞培養于含5%胎牛血清的DMEM/F12培養液中。實驗前換成無血清培養液同步化24 h。參照有關文獻[5]，分別加入含終濃度為0、50、100、200、400 μmol/L乙醛的培養液，繼續培養24 h。收集細胞或培養上清液進行實驗。

1.2.2逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測TGF-β1基因表達應用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化收集細胞，應用TRIzol試劑提取細胞總RNA，測定A260/A280=1.8～2.0，計算其水平。取1 μg總RNA反轉錄為cDNA。引物設計參考有關文獻[6]。TGF-β1(306 bp)：上游引物5′- AGG TCA CCC GCG TGC TAA T -3′，下游引物5′- TCA ACC ACT GCC GCA CAA CT -3′ 。β-actin (202 bp)：上游引物5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3′，下游引物5′-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′ 。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共28個循環后，72 ℃延伸7 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像系統中觀察結果，應用Bio-Rad聯機專用軟件分析電泳條帶灰度值。

1.2.3蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測TGF-β1蛋白表達應用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化收集細胞，加入含PMSF的細胞裂解液，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 g/min離心5 min提取總蛋白。BCA法檢測蛋白水平。取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗人TGF-β1多克隆抗體(1∶800)和小鼠抗人Tubulin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜。洗膜后分別加入堿性磷酶標記的山羊抗兔(1∶1 000)、山羊抗小鼠二抗(1∶1 000)，BCIP/NBT顯色。應用Image J圖像分析軟件分析TGF-β1及Tubulin條帶的灰度值。

1.2.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測細胞培養上清液中TGF-β1的水平收集細胞培養上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞培養上清液中TGF-β1的水平。

2　結　　果

2.1乙醛對細胞中TGF-β1基因表達的影響正常HK-2細胞中有少量的TGF-β1的基因表達，50 μmol/L乙醛刺激HK-2細胞24 h后TGF-β1的基因表達較對照組比較明顯增強(P<0.05)；隨著乙醛濃度的升高，TGF-β1的基因表達量明顯增加，并具有一定的濃度依賴性。見圖1。

圖1　乙醛對TGF-β1基因表達的影響

2.2乙醛對細胞中TGF-β1蛋白表達的影響正常HK-2細胞中有少量的TGF-β1的蛋白表達，50 μmol/L乙醛刺激HK-2細胞24 h后TGF-β1的蛋白表達量沒有顯著增加(P>0.05)，但100 μmol/L乙醛刺激HK-2細胞24 h后TGF-β1的蛋白表達較對照組比較明顯增加(P<0.05)；隨著乙醛濃度的升高，TGF-β1的蛋白表達量明顯增加，具有一定的濃度依賴性。見圖2。

2.3乙醛對細胞培養上清液中TGF-β1的水平的影響正常HK-2細胞培養上清液中TGF-β1的水平很低(216.42±60.75)μg/L，100 μmol/L乙醛刺激HK-2細胞24 h后培養上清液中TGF-β1的水平開始增加(325.72±74.52)μg/L，較對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；隨著乙醛濃度的升高，培養上清液中TGF-β1的水平明顯增加，分別為(515.72±49.08)μg/L、(585.08±78.03)μg/L，具有一定的濃度依賴性。

圖2　乙醛對TGF-β1蛋白表達的影響

3　討　　論

長期大量飲酒可導致全身多臟器損害。機體攝入乙醇后約90%在肝臟代謝，攝入的乙醇在肝臟乙醇脫氫酶的作用下轉化為乙醛并進入血液循環。肝臟是乙醇代謝的主要器官，也是最容易損傷的器官。乙醛能夠刺激肝星狀細胞活化、增殖，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原及TGF-β1的表達明顯增加，是形成乙醇性肝硬化的中心環節[7-8]。由于腎臟的血供豐富，過量飲酒后，超過肝臟的代謝能力，容易導致過量的乙醇、乙醛在腎臟蓄積，從而引起腎臟損害。乙醇灌胃導致的大鼠腎損傷模型，病理表現為腎小管間質炎性細胞浸潤，α-SMA表達陽性[9]，促纖維化的細胞因子TGF-β1的表達明顯增強[10]，最終導致腎小管間質纖維化。

TGF-β1是目前公認的導致腎小管間質纖維化作用最強的細胞因子。本課題建立了乙醇的代謝產物乙醛導致腎小管上皮細胞損傷的體外模型。進一步研究證實，乙醛能夠促進體外培養的人腎小管上皮細胞合成分泌TGF-β1。TGF-β1可能通過自分泌或旁分泌的方式，導致腎小管上皮細胞凋亡、轉分化為肌成纖維細胞、促進致炎性細胞因子的釋放等環節[11-13]，促進腎小管間質纖維化的發生、發展。采取措施阻斷乙醛對腎小管上皮細胞內TGF-β1的合成及分泌，對減輕乙醛對腎小管上皮細胞的損傷，保護腎小管上皮細胞功能，延緩腎小管間質纖維化的進展具有一定的臨床意義。

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Effects of acetaldehyde on synthesis and secretion of TGF-β1in human renal tubular epithelial cells

Zhang Linxia1,Li Xiaodong2△

(1.Third Department of Geriatrics;2.Department of Nephrology,Tangshan City Workders′ Hospital, Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of acetaldehyde on synthesis and secretion of transforming growth factor-β1(TGF-β1) in human renal tubular epithelial cells,and to explore the mechanism of alcohol induced renal tubulointerstitial fibrosis.MethodsIn vitro,the human renal tubular epithelial cells (HK-2 cell line) were cultured in DMEM/F12 medium supplemented with 5% fetal bovine serum.The cells were exposed to acetaldehyde at various concentrations (0,50,100,200 and 400 μmol/L) for 24 h.The expression of TGF-β1gene in HK-2 cells was detected by RT-PCR;and the expression of TGF-β1protein was detected by Western blot;The content of TGF-β1in the supernatant of the cells was measured by ELISA assay.ResultsRT-PCR and Western blot results showed that acetaldehyde increased the expressions of TGF-β1gene and protein in HK-2 cells in a dose-dependent manner.The results of ELISA method showed that acetaldehyde increased the content of TGF-β1in the supernatant of HK-2 cells in a dose-dependent manner.ConclusionAcetaldehyde can promote the synthesis and secretion of TGF-β1in cultured human renal tubular epithelial cells in vitro,thus promoting the progress of renal tubulointerstitial fibrosis.

acetaldehyde;renal tubular epithelial cells;transforming growth factor-β1;renal tubulointerstitial fibrosis

張林霞(1971-)，副主任醫師，碩士，主要從事腎臟方面的研究。△

，E-mail:2460789769@qq.com。

論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.005

R392.11

A

1671-8348(2016)22-3038-02

2016-02-25

2016-04-11)