茶多酚對鋁致大鼠睪丸支持細胞損傷的拮抗作用研究*

王程強，歐超燕，施文祥，錢　波

(桂林醫學院公共衛生學院，廣西桂林 541004)

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茶多酚對鋁致大鼠睪丸支持細胞損傷的拮抗作用研究*

王程強，歐超燕，施文祥，錢波△

(桂林醫學院公共衛生學院，廣西桂林 541004)

目的探討茶多酚(TP)對鋁暴露大鼠睪丸支持細胞損傷的拮抗作用。方法原代培養大鼠睪丸支持細胞。將細胞分為0 μmol/L AlCl3(對照組)、400 μmol/L AlCl3(鋁暴露組)、40 μg/mL TP +400 μmol/L AlCl3組(低劑量拮抗組)、160 μg/mL茶多酚+400 μmol/L AlCl3組(高劑量拮抗組)，各組用相應的藥物處理24 h。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測各組細胞的生長活性；逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測抑制素B(INHB)mRNA的表達。結果與對照組比較，鋁暴露組的細胞活性、INHB mRNA表達均明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與鋁暴露組比較，低劑量拮抗組、高劑量拮抗組能夠明顯提高細胞活性，差別具有統計學意義(P<0.05)。與鋁暴露組比較，高劑量拮抗組能夠明顯提高INHB mRNA表達，差異有統計學意義(P<0.05)。結論高劑量TP能夠拮抗鋁對大鼠睪丸支持細胞的損傷。

茶多酚；三氯化鋁；睪丸支持細胞；抑制素B

鋁在環境中和人類的生活中廣泛存在，且能夠在人體里逐漸蓄積，其毒性主要表現為神經系統的損傷。除了神經毒性外，近年來發現鋁對生殖系統也有毒性。無論是流行病學研究還是整體動物實驗，都證實了鋁會對雄性的生殖系統帶來損傷。有研究顯示，鋁暴露將導致雄性小鼠的睪丸、附睪質量減輕，導致精子數量和質量顯著下降[1]，但是作用機制目前仍不清楚。睪丸支持細胞是睪丸組織中重要的保姆細胞，它能夠為精子提供穩定的微環境，為生精提供所需的營養物質與能量，還能分泌大量的生長因子參與生精細胞的分化和成熟，其功能的受損將對精子的生成產生巨大的影響。因此，睪丸支持細胞被認為是評價雄性生殖毒性的重要靶細胞[2]。支持細胞所分泌的抑制素B(INHB)能直接反映其功能狀態，一旦生精受到抑制，INHB的水平將發生變化[3-4]。目前排鋁藥物主要是鋁螯合劑，但其不良反應多。近年來，患者對于不良反應小的天然藥物的需求越來越高，開發出一種不良反應比較小的驅鋁藥物迫在眉睫[5]。茶多酚(TP)是一種天然的強抗氧化劑，可以預防腫瘤及神經退行性疾病[6-7]。但其能否保護鋁暴露的睪丸支持細胞，目前未見報道。本研究將探討TP對鋁暴露大鼠睪丸支持細胞的保護作用，并初步研究其可能的發生機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠6只，18～22 d，以體質量50～55 g睪丸未降出腹腔為標準。由桂林醫學院實驗動物中心提供。

1.1.2主要儀器與試劑TP(浙江東方茶葉科技有限公司，≥95%)，氯化鋁(分析純，廣州化學試劑廠產品)，DMEM/F12培養液(Gibco公司)，胎牛血清(武漢谷歌生物有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)，膠原酶Ⅰ(美國Sigma公司)，胰蛋白酶(Difco公司)，第一鏈cDNA試劑盒和PCR試劑盒(北京賽百盛公司)，酶標儀(奧地利Tecan公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠睪丸支持細胞原代培養[8]頸椎脫臼法處死大鼠。鼠體置于75%乙醇中浸泡2 min,然后利用眼科剪在超凈工作臺中取出大鼠睪丸，放入含有預冷的D-Hanks液的培養皿中。剝除睪丸被膜，用眼科剪把睪丸實質剪碎成約1 mm3的碎塊。加入D-Hanks液，靜置5 min后，沖洗2次。采取胰蛋白酶和膠原酶二步法消化組織。將睪丸組織碎塊加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴振蕩消化30 min。加入少量胎牛血清終止消化，800 r/min離心5 min去上清。加入無血清的培養基，1 000 r/min離心5 min去上清，再用D-Hanks液洗滌沉淀。再加2 mL 0.1%膠原酶Ⅰ液，37 ℃水浴振蕩消化20 min。取出后放入超凈臺，將消化液經100目不銹鋼篩過濾。加入少量含胎牛血清的DMEM/F-12培養液，制成細胞懸液。用0.4%臺盼蘭計數活細胞含量，補充適量含血清培養基，調節細胞濃度至合適。接種細胞在培養箱中，37 ℃ 5%CO2及飽和濕度條件下培養。48 h后棄培養液，用D-Hanks液沖洗，再用pH7.4的20 mmol/L Tris-HCl低滲處理3 min，以去除精原細胞。

1.2.2大鼠睪丸支持細胞的鑒定采取Feulgen染色法對大鼠睪丸支持細胞進行鑒定[9]。

1.2.3實驗分組及處理本實驗采用離體培養2 d后的原代細胞進行相關處理，將細胞分為0 μmol/L AlCl3(對照組)、400 μmol/L AlCl3(鋁暴露組)、 40 μg/mL TP+400 μmol/L AlCl3組(低劑量拮抗組)、160 μg/mL TP+400 μmol/L AlCl3組(高劑量拮抗組)，各組用相應的藥物處理24 h。

1.2.4MTT法檢測細胞生長活性調整細胞密度5×105/mL接種在96孔板中,每孔200 μL，每組設6個復孔。于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養48 h后，施加相關處理因素。各組細胞經過相關處理24 h后，加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續培養4 h后，棄培養液，每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫下振蕩10 min,使結晶物體完全溶解。利用酶標儀在490 nm波長下檢測各孔的吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.2.5采取RT-PCR法檢測大鼠睪丸支持細胞中INHB mRNA表達水平將培養于96孔板的各組細胞經過24 h處理后，加入Trizol提取RNA，并逆轉錄cDNA，具體步驟嚴格按照試劑說明書進行。INHB：上游引物5′-CTC TGC TGC TGC TCC TTT TG-3′,下游引物5′-TGG TGG CTG CGT ATG TG-3′，產物片段361 bp。內參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：上游引物5′-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GAG T-3′,下游引物5′-CAG TCT TCT GAG TGG CAG TGA T-3′，產物片段292 bp。引物均由北京賽百盛基因技術有限公司合成。以2 μL cDNA為模板，建立PCR反應體系[包括10×PCR緩沖液5 μL,MgCl27 μL,三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)2 μL,上下游引物各1 μL，2 μL cDNA，Taq酶1 μL，滅菌雙蒸水31 μL]。PCR反應條件： 95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min;60 ℃ 10 min循環35次。5 μL用瓊脂糖凝膠電泳分離，采取Gene Tools分析條帶A值，以INHB與GAPDH的比值代表其mRNA的相對表達量。

1.3統計學處理運用SPSS 18.0統計軟件對數據進行分析，采用單因素方差分析，SNK-q檢驗運用于各組之間的兩兩比較，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1茶多酚對鋁暴露支持細胞活性的影響支持細胞活性鋁暴露組(0.822±0.028)、低劑量拮抗組(0.933±0.033)、高劑量拮抗組(0.950±0.026)與對照組(1.008±0.044)相比較，差異有統計學意義(P<0.05)。低劑量拮抗組、高劑量拮抗組與鋁暴露組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2TP對鋁暴露大鼠睪丸支持細胞INHB mRNA表達的影響INHB mRNA鋁暴露組(0.333±0.022)、低劑量拮抗組(0.365±0.010)、高劑量拮抗組(0.412±0.019)與對照組(0.452±0.011)相比較，差異有統計學意義(P<0.05)。高劑量拮抗組與鋁暴露組INHB mRNA表達相比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

M：DNA標記物;1～4:鋁暴露組、對照組、高劑量拮抗組、低劑量拮抗組。

圖1INHB mRNA RT-PCR產物電泳結果

3　討　　論

睪丸是鋁雄性生殖毒性最敏感的器官之一。生精功能的障礙和睪酮合成的抑制是鋁雄性生殖毒性的主要表現形式。有研究發現，給小鼠腹腔注射三氯化鋁，隨著劑量的增加，生精細胞和睪丸支持細胞都明顯減少[10]。鋁暴露會導致睪丸組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力下降，增加丙二醛(MDA)的含量[11]。鋁暴露將產生大量的活性氧化簇，促進脂質過氧化損傷，導致精母細胞和精子壞死。正常精子的生成，都需要睪丸支持細胞。睪丸支持細胞具有保護、營養和支持生精細胞的功能。有研究證實，卵泡刺激素(FSH)能夠選擇性刺激支持細胞分泌INHB。FSH對雌性的生殖影響是巨大的、絕對的[12]，然而對雄性來說，FSH的影響是比較細微的。如果通過基因敲除法敲除FSH基因，雌性動物不育，而雄性小鼠卻依然可以生育。此外，INHB和精子濃度有很好的正相關性。鋁導致睪丸氧化損傷依然是最主要的機制。有研究表示鋁暴露后，將產生大量的一氧化氮合酶，從而抑制環磷酸腺苷(cAMP)，使睪酮的分泌將減少，導致精子濃度下降。隨著cAMP活性的下降，睪丸間質細胞轉運膽固醇進入線粒體的量也隨之減少[13]。

本實驗發現，與對照組比較，鋁暴露組的細胞活性、INHB mRNA表達均明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。INHB對FSH的負反饋作用要強于正反饋。說明支持細胞在受到鋁暴露后，將負反饋降低抑制素的表達，減少對FSH的抑制，促進FSH分泌雄激素結合蛋白(ABP)。ABP能與睪酮結合，從而拮抗鋁對支持細胞的損傷效應。

TP是一類富含酚羥基的化合物，提供活性氫，使自由基滅活，清除自由基過多引起的DNA損傷[14]。TP還能抑制誘導型一氧化氮合成酶mRNA的表達，從而阻斷一氧化氮的合成[15]。而抑制素的轉錄主要是受到FSH刺激的cAMP的影響。本研究發現，TP能夠通過增加抑制素的轉錄，拮抗鋁對睪丸支持細胞的損傷效應，增加睪丸支持細胞活性。其機制可能是提高cAMP活性，抑制一氧化氮合酶的產生，從而拮抗鋁對睪丸支持細胞的損傷。

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The antagonistic effects of tea polyphenols on damage of rat sertoli cells induced by Aluminum chloride*

Wang Chengqiang,Ou Chaoyan,Shi Wenxiang,Qian Bo△

(School of Public Health，Guilin Medical College,Guilin，Guangxi 541004，China)

ObjectiveTo observe the antagonistic effects of tea polyphenols on the damage of sertoli cells of rats induced by Aluminum chloride.MethodsRat sertoli cells were cultured,purified and identified.Cells were divided into 0 μmol/L AlCl3(control group),400 μmol/L AlCl3(Aluminum exposure group) and 40 μg/mL TP+400 μmol/L AlCl3group (low dose anti group) and 160 μg/mL tea polyphenol + 400 μmol/L AlCl3group (high dose of anti group),each group with the corresponding drug treatment for 24 h.MTT method was used to detect the growth activity of the cells in each group,the levels of INHB mRNA expression were measured by RT-PCR.ResultsCompared with the control groups,the cell viability and the level of INHB mRNA expression of Aluminum exposure groups were obviously decreased,there were statistical significant differences(P<0.05).Compared with the Aluminum exposure group,the cell viability of low dose anti group and high dose of anti group was remarkably increased,there were statistical significant differences(P<0.05).Compared with the Aluminum exposure group,the level of INHB mRNA expression of high dose of anti group was remarkably increased,there was statistial significant difference(P<0.05).ConclusionHigh dose of tea polyphenols can enhance the expression of mRNA,increase the cell activity,and antagonism Aluminum on the injury of rat′s testis.

tea polyphenols;Aluminum chloride;sertoli cell;inhibin-B

廣西科技廳自然基金青年基金一般項目(2012GXNSFBA053120)；廣西教育廳高等學校一般資助項目(201203YB121)。作者簡介：王程強(1981-)，講師，碩士，主要從事毒理學的相關研究。△

，E-mail:805558188@qq.com。

論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.003

R697

A

1671-8348(2016)22-3031-03

2016-02-15

2016-04-20)