響應面法優化假單胞菌產胞外多糖發酵培養基

王曉霞，趙　晨，趙祥穎，劉建軍，*，張家祥

（1.齊魯工業大學 食品與生物工程學院，山東 濟南 250353；2.山東省食品發酵工程重點實驗室，山東 濟南 250013）

響應面法優化假單胞菌產胞外多糖發酵培養基

王曉霞1，趙晨2，趙祥穎2，劉建軍1，2*，張家祥2

（1.齊魯工業大學 食品與生物工程學院，山東 濟南 250353；2.山東省食品發酵工程重點實驗室，山東 濟南 250013）

采用響應面法對假單胞菌（Pseudomonassp.）FJY5-13生產胞外多糖的發酵培養基進行優化。通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗及Box-Behnken試驗構建回歸方程，結果表明，最佳發酵培養基成分為甘油83.0 g/L、酵母浸粉5.7 g/L、NaCl 8.2 g/L、檸檬酸鈉5 g/L、（NH4）2SO41 g/L、玉米漿粉7.5 g/L，在此條件下，胞外多糖的產量為10.50 g/L，約為優化前多糖產量7.9 g/L的1.3倍。

假單胞菌；胞外多糖；響應面；發酵培養基；優化

微生物胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是微生物在生長過程中為適應周圍環境的變化產生的對自身具有保護作用的生物高聚物［l］。微生物代謝產物對人類生存發展具有重大意義，它能夠提高動物、植物本身的免疫力，不僅是保護細胞免受外界環境的屏障，也是細菌細胞的識別分子［2］。微生物胞外多糖因其獨特的理化性質，已發展成為一類新型的發酵產品，目前已作為增稠劑、穩定劑、乳化劑、保濕劑、膠凝劑、懸浮劑等廣泛應用于石油、化工、食品和制藥等多個領域［3-4］。野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）分泌得到的大分子多糖具有獨有的高黏性、增稠性及流變特性，使其廣泛應用于食品、紡織、印染等領域［5］。MATSUDA M等［6］研究表明，假單胞菌屬中的Pseu domonassp.產生的硫酸鹽多聚糖（sulfate polysaccharide）能夠明顯的增強小鼠的免疫力，表明了該多糖具有抗癌活性。胞外多糖特有的抗氧化、抗癌及抗腫瘤特性［7］，因此其具有潛在的藥用價值。

響應面優化可以通過擬合回歸方程以構建連續變量曲面預測模型，從而能夠對影響響應的不同因子水平及其交互作用進行優化和評價，所需試驗次數較少，因此被成功地應用于各種優化過程中［8-10］。前期工作從高鹽、高滲環境中分離篩選到一株假單胞菌（Pseudomonassp.），本研究在單因素試驗的基礎上采用Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗及Box-Behnken試驗［11-13］對該菌株產胞外多糖的最佳培養基進行了優化，進一步提高了假單胞菌胞外多糖的發酵產率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

假單胞菌（Pseudomonassp.）FJY5-13：由山東省食品發酵工程重點實驗室篩選保存。

1.1.2培養基

斜面培養基：甘油50 g/L，檸檬酸鈉5 g/L，酵母浸粉5g/L，玉米漿干粉7.5g/L，（NH4）2SO41g/L，NaCl5g/L，瓊脂15 g/L，pH值為7.0。

液體種子培養基：甘油50 g/L，檸檬酸鈉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，NaCl 5 g/L，pH值為7.0。

搖瓶/基礎發酵培養基：甘油80 g/L，檸檬酸鈉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，NaCl 5 g/L，pH值為7.0。

1.1.3試劑

甘油、硫酸銨（（NH4）2SO4）、檸檬酸鈉、苯酚、氯化鈉（NaCl）、質量分數95%濃硫酸（均為分析純）：天津市化學試劑三廠；酵母浸粉（總氮≥10%）：安琪酵母股份有限公司；瓊脂條、玉米漿干粉：山東西王集團淀粉廠。

1.2儀器與設備

BS124S電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；HH 600數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；7200型紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；HV-110高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；QYC-211臥式恒溫（全溫）雙層培養搖床：上海新苗實驗儀器。

1.3試驗方法

1.3.1培養方法

種子活化：將假單胞菌接種到斜面培養基上，30℃培養，12 h。

種子培養：在500 mL錐形瓶中裝入液體種子培養基50 mL，在121℃條件下，滅菌20 min，從斜面培養基挑去一環活化好的假單胞菌接入后進行搖瓶培養，30℃、180r/min振蕩培養9 h。

搖瓶培養：在500 mL錐形瓶中裝入搖瓶發酵培養基50 mL，將種子液按4%接種量接入到發酵培養基中，30℃、180 r/min振蕩培養72 h。

1.3.2胞外多糖產量的測定［l4］

發酵液經16 000 r/min離心15 min去除菌體，取上清液加入乙醇醇沉得到沉淀，將沉淀用去離子水溶解，吸取1mL樣品溶解液，加入1 mL蒸餾水，1 mL 5%苯酚和5 mL 95%濃硫酸，靜置10 min，搖勻，室溫下靜置20 min，在波長490 nm處測定其吸光度值，根據葡萄糖標準曲線回歸方程（y=0.007 8x+0.001 9，R2=0.996 4）計算得到多糖產量。

1.3.3Plackett-Burman設計

在前期單因素試驗基礎上，利用Plackett-Burman設計對發酵培養基中的6個主要因素進行全面考察，每個因素取高低2個水平，高水平約為低水平的1.5倍［15］，Plackett-Burman試驗因素與水平如表1所示。

表1　Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments g/L

1.3.4最陡爬坡試驗

通過對Plackett-Burman設計的試驗結果進行分析，確定主要因子，根據回歸方程各因子的系數來確定主要因子的爬坡路徑和步長［16］，得到響應面試驗的中心點，即各個顯著因素的最佳質量濃度，確定最大響應值的區域。

1.3.5響應面分析試驗方法

Plackett-Burman設計確定影響假單胞菌胞外多糖產量的3個主要因素，最陡爬坡試驗確定3個主要因素響應區域的中心點，運用Box-Behnken的中心組合設計原理，從3個主要因素的響應區域各取3水平，設計3因素3水平試驗進行響應面的分析，從而獲得菌株高產胞外多糖的培養基組成。

2　結果與分析

2.1Plackett-Burman試驗

按照N=6的Plackett-Burman設計進行試驗，每組進行3次平行試驗，搖瓶發酵3 d，以胞外多糖的產量為其響應值。Plackett-Burman試驗設計及結果如表2所示，各個因素的效應及顯著性如表3所示。

表2　Plackett-Burman設計及結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman

表3　Plackett-Burman試驗顯著因子分析Table 3 Analysis of significant factors of Plackett-Burman experiments

由表3可知，在發酵培養基中，甘油，酵母浸粉，NaCl及（NH4）2SO4表現為正效應，玉米漿粉、檸檬酸鈉表現為負效應。由P值的大小可知，發酵培養基中各因素對菌株發酵生產胞外多糖影響的重要性排序為D＞A＞E＞F＞C＞B，即酵母浸粉＞甘油＞NaCl＞檸檬酸鈉＞（NH4）2SO4＞玉米漿粉，顯著性影響（P＜0.05）的因素有酵母浸粉、甘油和NaCl。因此，選擇甘油、酵母浸粉和NaCl作為顯著因素進行下一步的試驗。

2.2最陡爬坡試驗確定試驗因素水平的中心點

根據Plackett-Burman設計篩選出顯著因素及效應大小的比例設定它們的變化步長，最快的逼近最佳值區域［13］。最陡爬坡試驗設計結果如表4所示。

表4　最陡爬坡試驗設計結果Table 4 Design and results of the steepest ascent path experiments

由表4可知，第2組試驗胞外多糖產量最大，即甘油85 g/L，酵母浸粉5.5 g/L，NaCl 8.5 g/L時胞外多糖產量達到最大值，因此以此為中心點進行響應面試驗分析。

2.3Box-Behnken試驗設計與響應面試驗分析

由上述2.2節確定了顯著因子的最佳濃度范圍，根據Box-Behnken的中心組合設計原理，在主要因素的響應區取3個水平，運用軟件Design-Expert V8.0.6軟件設計3因素3水平的響應面試驗，每個試驗進行3次重復，Box-Behnken試驗因素與水平如表5所示，響應面分析試驗設計及結果見表6，回歸方程的方差分析結果見表7。

表5　Box-Behnken試驗因素與水平Table 5 Factors and levels of Box-Behnken experiments

根據Box-Behnkon試驗設計原理進行響應面分析試驗，獲得15個試驗點，該15個試驗點可以分為2類：一是析因點，自變量取值在X1、X2和X3所構成的三維頂點，共12個析因點；二是零點，為區域的中心點，零點試驗重復3次，用以估計試驗誤差［17］。根據表6試驗結果，運用Design-Expert V 8.0.6軟件對其進行多元回歸擬合方差分析，擬合得到的回歸方程為：

由表7可知，在回歸模型中，因素X12、X22、X32表現影響極其顯著（P＜0.01），X1表現影響顯著（P＜0.05），失擬項的P值0.260 3＞0.05，影響不顯著，表明了試驗誤差很小，其他未知因素對該試驗影響極小。決定系數R2為0.974 3＞0.9，說明模型達到了較好的擬合程度［18］，調整后的R2adj=0.944 1說明了回歸方程中自說明了回歸方程中自變量可以94.41%的解釋胞外多糖的結果，變異系數（coefficient of variation，CV）為5.05%＜10%，信噪比（signal to noise ratio，SNR）為13.38＞4.0，說明了該方程的相關性良好，試驗穩定，可信度高，也從側面說明了回歸方程的擬合性很好。

表6　響應面分析試驗設計及結果Table 6 Design and results of response surface methodology

表7　回歸方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.4響應面交互作用結果分析［19］

固定其中的一個因素，利用軟件Design-Expert做另外兩個因素交互作用的曲面圖及等高線圖，確定甘油、酵母浸粉及氯化鈉濃度對胞外多糖產量的影響結果見圖1。

圖1　甘油、酵母浸粉和NaCl交互作用對胞外多糖產量影響的響應曲面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glycerinum，yeast extract powder and NaCl on polysaccharide yield

由圖1可知，甘油濃度、酵母浸粉濃度、氯化鈉濃度相互作用對假單胞菌胞外多糖產量的影響均出現拋物面型關系，所得到的響應面都存在一個極大值點。其中甘油濃度與酵母浸粉濃度之間的交互作用最為明顯。

2.5最佳培養基濃度的預測與驗證

經過響應面法優化，軟件Design-Expert分析得到的假單胞菌產胞外多糖的最佳培養基成分為甘油83.26 g/L、酵母浸粉5.72 g/L、NaCl 8.24 g/L，在此條件下，理論所得到的胞外多糖產量為10.32 g/L。

為了驗證所得到的最佳培養基組成是否可靠，同時考慮了實際操作的可行性，將培養基成分調整為甘油83.0g/L、酵母浸粉5.7 g/L、NaCl 8.2 g/L，進行3次重復試驗，得到胞外多糖的平均產量為10.50 g/L，與預測值接近，約為優化之前的最高產量7.9 g/L的1.3倍，進一步說明該模型能夠很好地預測實際的發酵情況。

3　結論

本研究通過Plackett-Burman試驗快速有效的從6個影響因素確定甘油、酵母浸粉和NaCl為影響胞外多糖發酵的主要因素，在此基礎上進行最陡爬坡試驗設計，逼近最大響應面區域，然后采用Box-Behnken試驗設計，確定了3種主要影響因素的質量濃度經過驗證試驗，該菌種生產胞外多糖的最佳培養基成分為甘油83.0 g/L，酵母浸粉5.7 g/L，NaCl 8.2 g/L，檸檬酸鈉5 g/L，玉米漿粉7.5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，在此條件下，胞外多糖的產量高達10.50 g/L，約為基礎培養基發酵得到的胞外多糖產量7.90g/L的1.3倍。這表明響應面法在培養基優化方面具有一定的指導作用。

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Optimization of fermentation medium of exopolysaccharide-producingPseudomonassp. by response surface methodology

WANG Xiaoxia1，ZHAO Chen2，ZHAO Xiangying2，LIU Jianjun1，2*，ZHANG Jiaxiang2
（1.College of Food and Biological Engineering，QiLu University of Technology，Jinan 250353，China；2.Food&Fermentation Engineering Key Laboratory of Shandong Province，Jinan 250013，China）

The fermentation medium of exopolysaccharide-producingPseudomonassp.FJY5-13 was optimized by response surface methodology.The regression equation was established by Plackett-Burman，the steepest ascent path and Box-Behnken experiments.The results showed the optimum fermentation medium components were as followed：glycerin 83.0 g/L，yeast extract 5.7 g/L，NaCl 8.2 g/L，sodium citrate 5 g/L，（NH4）2SO41g/L and corn steep powder 7.5 g/L.Under the conditions，exopolysaccharide yield was10.50 g/L，which was1.3 timeshigher than thatbefore optimization（7.9 g/L）.

Pseudomonassp.；exopolysaccharide；response surface methodology；fermentation medium；optimization

Q939

0254-5071（2016）03-0080-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.018

2015-12-30

山東省科技發展計劃（2014GSF121038）

王曉霞（1986-），女，碩士研究生，研究方向為微生物技術及應用。

劉建軍（1962-），男，研究員，博士，研究方向為微生物技術及應用。