產(chǎn)酒酵母的篩選鑒定及其在小曲中的應(yīng)用

邊名鴻，萬(wàn)世旅，代　梅，李小兵

（1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；3.漢源縣國(guó)有皇木林場(chǎng)，四川 雅安 625000）

產(chǎn)酒酵母的篩選鑒定及其在小曲中的應(yīng)用

邊名鴻1，2，萬(wàn)世旅1，2，代梅1，李小兵3

（1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；3.漢源縣國(guó)有皇木林場(chǎng)，四川 雅安 625000）

以采自川西南片區(qū)的10種曲樣中分離出的18株酵母為研究對(duì)象，以產(chǎn)酒能力為主要指標(biāo)，通過(guò)三級(jí)篩選得到一株優(yōu)良產(chǎn)酒酵母Y-18，經(jīng)分子鑒定確定其為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。將其制作成純種的酵母曲并和根霉曲進(jìn)行復(fù)配試飯。結(jié)果表明，酵母Y-18在大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基中的殘?zhí)呛孔畹停凭茸罡撸謩e為0.69 g/100 mL和10.3%vol；在60 g蒸熟大米中，添加酵母曲1.8 g、根霉曲0.5 g時(shí)，試飯酒精度最高（7.24%vol）、酸度適中、糖分最低。

產(chǎn)酒酵母；篩選；鑒定；小曲；應(yīng)用

小曲酒是中國(guó)白酒的主要酒種之一，傳統(tǒng)小曲酒是以小曲作為糖化劑和發(fā)酵劑，以高粱、大米、玉米、小麥等為原料釀造而成，具有一種清雅的香氣和醇甜的口感。小曲白酒的生產(chǎn)，由于具有設(shè)備簡(jiǎn)單，投資少、點(diǎn)多面廣、操作簡(jiǎn)便、發(fā)酵期短、出酒率高、用曲量少、原料廣泛、適于地產(chǎn)地銷等特點(diǎn)而深受釀酒廠家和廣大消費(fèi)者喜愛(ài)［1-2］。

川法小曲酒的研究主要集中在提高其產(chǎn)酒率和風(fēng)味上，因此優(yōu)良菌種的篩選及應(yīng)用至關(guān)重要。李銳利［3］從收集到的小曲酒酒曲中分離篩選出一株產(chǎn)乙酸乙酯性能較高的酵母菌株BY2，在優(yōu)化產(chǎn)酯條件下BY2的產(chǎn)酯量為4.812 g/L，較優(yōu)化之前的方案產(chǎn)酯量提高了37.5%；鄧開(kāi)野等［4］從甜酒曲中經(jīng)分離、誘變、篩選后得到1株高糖化力的根霉菌株，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，糖化力達(dá)到1 317 mg/（h·g），具有一定應(yīng)用價(jià)值；張翠英等［5］通過(guò)添加低產(chǎn)高級(jí)醇菌株進(jìn)行小曲酒半固態(tài)發(fā)酵，小曲酒酒精度、殘?zhí)恰⒖偹岷涂傰セ緹o(wú)影響，但卻使高級(jí)醇含量大幅度下降，與純小曲發(fā)酵相比降低了37.2%。從發(fā)酵基質(zhì)和自然界中直接篩選培育耐高濃度酒精的酵母菌，是目前獲取高產(chǎn)酒精酵母的一種既經(jīng)濟(jì)又實(shí)用的方法［6］，這些酵母菌在人工生產(chǎn)中經(jīng)過(guò)不斷馴化，在高產(chǎn)、耐高濃度酒精及遺傳性能方面比較穩(wěn)定。本研究從曲樣中篩選適應(yīng)力較強(qiáng)、發(fā)酵力強(qiáng)、產(chǎn)酒性能良好的酵母，為后續(xù)應(yīng)用于小曲白酒生產(chǎn)的研究奠定基礎(chǔ)，對(duì)提高原料的出酒率和成品酒的質(zhì)量穩(wěn)定性也有一定的積極作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種及主要試劑

成都、瀘州等地的10種不同曲樣中分離出的18株酵母，編號(hào)Y-1～Y-18。試飯對(duì)比小曲為市售酒曲。3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2培養(yǎng)基

TTC上層培養(yǎng)基［7］，TTC下層培養(yǎng)基［7］；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）培養(yǎng)基［8］；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基；20°Bx大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基［9］；20°Bx高粱發(fā)酵培養(yǎng)［9］。

1.2儀器與設(shè)備

MYT型糖度儀：上海滬粵明科技儀器有限公司；Super Alcomat型酒精度測(cè)定儀：北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所；UV-200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼柯有限公司；LHR型智能生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；BS-2F型數(shù)控恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱：常州精成國(guó)華儀器有限公司；MLS-3020型全自動(dòng)高壓滅菌鍋：日本三洋公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1產(chǎn)酒酵母的初篩

將從6種曲樣中分離純化的酵母菌株接種至TTC下層培養(yǎng)基上，30℃條件下倒置培養(yǎng)48 h后倒入TTC上層培養(yǎng)基，保溫2 h觀察菌落顏色深淺。

1.3.2產(chǎn)酒酵母的復(fù)篩

將經(jīng)TTC初篩獲得的酵母菌接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基中30℃、110 r/min培養(yǎng)24 h。取活化菌液計(jì)數(shù)調(diào)整菌懸液中酵母細(xì)胞數(shù)為108CFU/mL，按10%的接種量分別接種于高粱發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃靜置發(fā)酵。每隔12 h振蕩稱質(zhì)量并記錄CO2失重，直到12 h的CO2失重＜0.2 g時(shí)停止發(fā)酵，每株菌設(shè)計(jì)3個(gè)平行對(duì)照組，篩選出最適發(fā)酵培養(yǎng)基和CO2失重較好的產(chǎn)酒酵母進(jìn)行三級(jí)篩選。

1.3.3產(chǎn)酒酵母的三級(jí)篩選

將復(fù)篩獲得的產(chǎn)酒酵母接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基中110 r/min、30℃培養(yǎng)24 h，取活化菌液計(jì)調(diào)整菌懸液中酵母細(xì)胞數(shù)為108CFU/mL，10%的接種量接種至1.3.2中篩選出的最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃條件下靜置發(fā)酵84 h，發(fā)酵結(jié)束后采用DNS法測(cè)定樣液中的殘?zhí)牵?0-11］，比重法測(cè)定100 mL蒸餾樣液中的酒精度，每株菌設(shè)計(jì)3個(gè)平行對(duì)照組。

1.3.4產(chǎn)酒酵母的鑒定

將篩得的酵母送往上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行鑒定。

1.3.5酵母曲與根霉曲的復(fù)配試飯

將篩選出的優(yōu)良產(chǎn)酒酵母制作成純種酵母曲［12］，并和根霉曲進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配方案如表1所示。將復(fù)配好的曲接入60 g蒸熟的大米中，于30℃條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出，用DNS法測(cè)定其試飯?zhí)欠郑味ǚy(cè)定酸度［13］，比重法測(cè)定蒸餾液的酒精度，每組做3個(gè)平行，并與市售小曲進(jìn)行對(duì)比。

表1　酵母曲與根霉曲復(fù)配方案Table 1 The compound plans of yeastQuandRhizopus Qu

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)酒酵母的初篩

TTC可與酵母的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，酵母的產(chǎn)酒精能力越強(qiáng)則與TTC反應(yīng)后菌落的呈色越深，利用TTC培養(yǎng)基對(duì)18株酵母進(jìn)行初篩，顯色結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，顏色較深（較紅）的7株酵母菌株編號(hào)分別為Y-10、Y-12、Y-13、Y-14、Y-16、Y-17、Y-18，將經(jīng)過(guò)TTC平板篩選得到的酵母做進(jìn)一步復(fù)篩。

圖1　TTC與酵母顯色結(jié)果Fig.1 The chromogenic results of TTC and yeast

2.2產(chǎn)酒酵母的復(fù)篩

發(fā)酵周期和發(fā)酵速度是考察釀酒酵母發(fā)酵性能的重要指標(biāo)，酵母菌利用可發(fā)酵性糖，生成乙醇和二氧化碳，因此可利用發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液減少的二氧化碳量來(lái)衡量酵母的發(fā)酵性能［14］。將7株菌Y-10、Y-12、Y-13、Y-14、Y-16、Y-17、Y-18制成菌懸液，稀釋至細(xì)胞數(shù)為108CFU/mL，按10%的量接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，每株菌設(shè)計(jì)3個(gè)平行對(duì)照組，每12 h觀察產(chǎn)氣情況及質(zhì)量變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，篩選菌種在相同條件下經(jīng)84 h發(fā)酵后，大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基的CO2失重整體高于葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和高粱發(fā)酵培養(yǎng)基；在3種發(fā)酵培養(yǎng)基中，7株酵母起酵速度都比較快，其中Y-16、Y-17和Y-18的累積CO2失重都在較高水平，最高在9.95～10.77 g，發(fā)酵速度上也優(yōu)于其他菌，各項(xiàng)指標(biāo)都較為穩(wěn)定，隨培養(yǎng)基的變化波動(dòng)較小。綜合以上分析，Y-16、Y-17和Y-18的發(fā)酵性能較好且相對(duì)穩(wěn)定，故選用菌株Y-16、Y-17和Y-18進(jìn)行三級(jí)篩選。

圖2　產(chǎn)酒酵母復(fù)篩CO2失重結(jié)果Fig.2 CO2weight loss results ofBaijiu-making yeast in the secondary screening

2.3產(chǎn)酒酵母的三級(jí)篩選

將Y-16、Y-17、Y-18三株菌接種于大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置發(fā)酵84 h檢測(cè)其酒精度與殘?zhí)侵笜?biāo)，結(jié)果如圖3所示。

圖3　產(chǎn)酒酵母三級(jí)篩選的殘?zhí)羌熬凭缺容^Fig.3 Comparison of residual sugar and alcohol content of the Baijiu-making yeast tertiary screening

酵母發(fā)酵消耗糖生成酒精，殘?zhí)橇吭降蛣t酒精度越高。由圖3可知，3株菌的發(fā)酵性能良好，經(jīng)過(guò)84 h發(fā)酵后酒精度均＞8.8%vol，殘?zhí)橇烤冢?.8 g/100 mL；菌株Y-18在糖度為20°Bx的發(fā)酵液中有較好的發(fā)酵特性，殘?zhí)橇枯^菌株Y-16和菌株Y-17低，還原糖利用率高，發(fā)酵比較徹底，產(chǎn)酒精能力也相對(duì)于其他兩株菌較強(qiáng)，其殘?zhí)橇亢途凭确謩e為0.69 g/100 mL和10.3%vol。

2.4產(chǎn)酒酵母的鑒定［15］

利用ITS1和ITS4一對(duì)引物對(duì)菌株Y-18的rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增序列測(cè)序，用BLAST將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，Y-18與Saccharomyces cerevisiae SCPW 17聚在一簇的相似度為100%，表明其很可能屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的一個(gè)種。

圖4　菌株Y-18的rDNA-ITS序列與其他近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain Y-18's rDNA-ITS sequence and other relative species

2.5純種酵母與根霉的復(fù)配曲試飯?jiān)囼?yàn)

試飯?jiān)囼?yàn)是檢驗(yàn)小曲質(zhì)量的有效方法，通過(guò)分析試飯后蒸餾液的酸度、酒精度及殘?zhí)强梢栽谝欢ǔ潭壬戏磻?yīng)出小曲在實(shí)際生產(chǎn)中的情況。本試驗(yàn)利用菌株Y-18的純種曲與實(shí)驗(yàn)室篩選的一株優(yōu)良根霉制作的根霉曲進(jìn)行復(fù)配，并與市售小曲進(jìn)行試飯?jiān)囼?yàn)對(duì)比，其結(jié)果如圖5所示。

圖5　不同復(fù)配方案的試飯結(jié)果Fig.5 The rice-testing results of different compound plans

由圖5可知，酵母菌和根霉在生長(zhǎng)上存在一定的相互影響；根霉曲的量多有利于前期的糖化過(guò)程，使得曲的糖化力增強(qiáng)，可為酵母發(fā)酵產(chǎn)酒提供更多的糖，酵母曲有利于后期的產(chǎn)酒，隨著酵母曲量的增加試飯的酒精度也隨之升高，酸度也有一定增加；在所考察的復(fù)配方案中，A10的試飯?zhí)欠肿畹汀⑺岫冗m中、酒精度最高，其酒精度為7.24%vol。而對(duì)比市售小曲酒精度為2.34%vol，還原糖的含量比較高，說(shuō)明對(duì)比小曲的發(fā)酵速度明顯慢于實(shí)驗(yàn)組。因此就48 h內(nèi)復(fù)配曲試飯的整體效果來(lái)看，試驗(yàn)組要好于對(duì)比市售小曲，該試驗(yàn)組菌種配比可作為小曲制作的參考配比。

3　結(jié)論

經(jīng)TTC顯色試驗(yàn)、產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，從18株酵母中篩選出一株優(yōu)良的產(chǎn)酒酵母Y-18，其菌落與TTC顯色后呈深紅，在大米粉發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵84 h后的CO2失重為10.77 g、酒精度為10.3%vol、殘?zhí)菫?.69 g/100 mL，經(jīng)分子鑒定確定其為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），將該菌株制作成純種的酵母曲并和根霉曲進(jìn)行復(fù)配研究，試飯結(jié)果表明，復(fù)配方案A10的試飯效果最佳，其糖度為4.63%、酸度為9.5 g/100 mL、酒精度為7.24%vol，可作為利用該菌株生產(chǎn)小曲的參考依據(jù)，因此，酵母菌Y-18作為生產(chǎn)小曲的菌種具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

［1］沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)全書［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.

［2］李一川.高質(zhì)量小曲白酒的研究［D］.武漢：湖北大學(xué)碩士論文，2014.

［3］李銳利.高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的選育及在清香型小曲酒中的應(yīng)用研究［D］.武漢：湖北工業(yè)大學(xué)碩士論文，2011.

［4］鄧開(kāi)野，林佩芳，黎爾納.甜酒曲中產(chǎn)糖化酶根霉菌株紫外誘變選育［J］.食品科學(xué)，2012，33（7）：204-208.

［5］張翠英，張艷英，齊亞楠，等.低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母工程菌株在小曲酒釀造中的應(yīng)用［J］.釀酒科技，2013（7）：62-64.

［6］王鵬.提高小曲微生物發(fā)酵性能的研究［D］.南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2014.

［7］郜希璐.白酒窖泥中酵母菌的分離鑒定及發(fā)酵特性研究［D］.天津：天津大學(xué)碩士論文，2009.

［8］KREGER V R N J W.The yeasts：a taxonomic study［M］.Netherlands：Elsevier Science Publishers B.V.，1984.

［9］賀小賢，常海山，丁勇，等.陜西稠酒小曲中高產(chǎn)酒精酵母的篩選和鑒定［J］.食品科技，2011，36（3）：10-13.

［10］王春曉，江璐，劉延琳.DNS法監(jiān)控葡萄酒發(fā)酵進(jìn)程的應(yīng)用研究［J］.中國(guó)釀造，2012，31（9）：24-27.

［11］許鵬，賈士儒，譚之磊，等.發(fā)狀念珠藻多糖和細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)葡萄糖濃度測(cè)定的影響［J］.中國(guó)釀造，2009，28（5）：144-146.

［12］肖冬光，趙樹欣，陳葉福，等.白酒生產(chǎn)技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2011.

［13］王福榮.釀酒分析與檢測(cè)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012.

［14］孫神英.不同酵母菌對(duì)白酒風(fēng)味成分的影響［D］.武漢：武漢輕工大學(xué)碩士論文，2014.

［15］褚學(xué)英，惠豐立，李曉輝.大曲中主要酵母菌的分子鑒定［J］.中國(guó)釀造，2008，27（5）：27-29.

Screening and identification ofBaijiu（liquor）-making yeast and its application in Xiaoqu

BIAN Minghong1，2，WAN Shilv1，2，DAI Mei1，LI Xiaobing3
（1.School of Biotechnology Engineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China；2.Sichuan University of Science&Engineering，Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Zigong 643000，China；3.State-owned Huangmu Forest Farm of Hanyuan，Ya'an 625000，China）

Using 18 strains yeast separated from 10 kinds ofBaijiu（liquor）starter samples of Sichuan southwest area as research object and using alcohol-producing ability as main indicator，a dominate strain，Baijiu-making yeast Y-18 was obtained by tertiary screening，and it was identified asSaccharomyces cerevisiaeby molecular identification.The yeast was made into purebred yeastQuand mixed withRhizopus Quto carry out the rice-testing experiments.The results indicated that in rice fermentation medium，the residual sugar content of yeast Y-18 was the lowest（0.69 g/100 ml）and the alcohol content was the highest（10.3%vol）.When the yeastQuaddition was 1.8 g andRhizopus Quaddition was 0.5 g in the 60 g steamed rice，the rice-testing had the highest alcohol content（7.24%vol），moderate acidity and the lowest residual sugar.

Baijiu（liquor）-making yeast；screening；identification；Xiaoqu；application

TS261.11

0254-5071（2016）03-0057-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.013

2015-12-15

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)基金項(xiàng)目（NJ2013-03）

邊名鴻（1979-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。