產酮基還原酶基因工程菌培養溫度和轉速條件的優化

張　松，李　嘯，*，石小丹，程　奔（.三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌 443003；.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

產酮基還原酶基因工程菌培養溫度和轉速條件的優化

張松1，李嘯1，2*，石小丹1，程奔2
（1.三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌 443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

考察了27℃、30℃、33℃、37℃條件下酮基還原酶基因工程菌生長與產酶的影響。結果發現，37℃以下隨著溫度的升高，菌體產酶活性得到提升和提前，37℃條件下10 h最大酶活達到了157.5 U/mL。但是所有溫度條件下的發酵后期，酶活都出現了下降，發酵后期轉速的下降可能是一個原因。因此對37℃下不同恒定轉速200 r/min、300 r/min、400 r/min、480 r/min的發酵條件進行了實驗。結果發現，轉速的恒定對于菌體酶活的積累具有重要意義，恒定轉速480 r/min條件下酶活逐漸升高，20 h的酶活為217.1 U/mL。此研究確定了酮基還原酶基因工程菌發酵產酶的最佳溫度和轉速，并對酮基還原酶進一步的補料分批發酵優化具有指導意義。

酮基還原酶；溫度；轉速；酶活

手性醇可用于合成手性藥物、農用化學品、香料和功能材料［1-2］。利用生物轉化制備光學純的手性化合物具效率高、選擇性強、成本低、裝置簡單、環境污染少等顯著優勢，引起了人們的廣泛興趣。S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（S-4-chloro-3-hydroxybu-tanoate esters，S-CHBE）作為他汀類藥物重要的手性砌塊，市場需求量極大，是目前生物催化與轉化領域研究的熱點，采用微生物法還原羰基化合物制備S-CHBE受到普遍關注［3］。酮基還原酶廣泛分布于從低等到高等的多種生物體內，是一種具有高度化學、區域和立體選擇性的生物催化劑，可以立體選擇性將4-氯乙酰乙酸乙酯（ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate，COBE）還原生成具有光學活性的CHBE［4］。微生物來源的酮基還原酶（ketoreduetase，KR）主要是醛酮還原酶系［5-6］，屬于短鏈醇脫氫還原酶家族（short-chainalcoholdehydrogenase/reductase，SDR），多數為單亞基胞內酶［7-8］。目前的研究主要集中于酮基還原酶的基因改造、輔酶再生以及生物催化過程優化等方面，而對于酮基還原酶發酵調控方面的報道較少。

大腸桿菌（Escherichia coli）高密度發酵是現代發酵領域逐漸興起的一項新技術，基因重組改造過的工程菌相對于普通的大腸桿菌發酵有自己特殊的發酵特性，需要進行一定的發酵條件優化。當前有關酮基還原酶發酵方面的研究主要集中在搖瓶水平［9-11］，考慮到搖瓶與發酵罐發酵的差異性，很多搖瓶條件下的實驗結果并不能很好的指導實際的發酵罐發酵，因此中試水平的發酵研究很有必要。大腸桿菌的最適生長溫度為37℃，但是最適產酶溫度可能會隨著酶的種類不同而不同，盡管溫度變化可能并不會特異性地改變外源蛋白的表達條件［12］。大腸桿菌雖然對攪拌引起的剪切力具有一定的耐受性，但是轉速的變化可能引起發酵流場的改變，進而影響菌體的發酵產酶環境。本實驗主要考察了溫度和轉速對酮基還原酶基因工程菌生長和產酶的影響，優化出了重組菌最適產酶的溫度和轉速參數，為后續補料分批發酵過程優化以及生產放大奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

重組大腸桿菌（Escherichia coli）KR-C：由安琪酵母股份有限公司菌種室提供。

1.1.2試劑

酵母蛋白胨、酵母抽提物：安琪酵母股份有限公司。L-阿拉伯糖：美國Sigma公司；還原型輔酶Ⅱ（NADPH）：上海源葉生物科技有限公司。4-氯-3-羥基丁酸乙酯（CHBE）：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3培養基

斜面培養基：酵母蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母抽提物5 g/L，瓊脂粉15 g/L。

搖瓶液體培養基：甘油10 g/L，酵母抽提物13.5 g/L，酵母蛋白胨31.5 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，MgSO40.5 g/L。

50 L發酵罐液體培養基：甘油20 g/L，酵母抽提物13.5 g/L，酵母蛋白胨31.5 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，MgSO40.5 g/L。

所有培養基均在121℃條件下滅菌20 min。

1.1.4誘導劑溶液

L-阿拉伯糖：質量濃度0.1 g/mL。

1.2儀器與設備

ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫搖床：上海智城生物科技有限公司；FUS-50L（A）型新概念發酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司；PAS7000型生物尾氣分析儀：重慶哈特曼科技有限公司；TDL-60B型飛鴿牌系列離心機：上海安亭科學儀器廠制造；SP-754型紫外可見光分光光度計：上海天普分析儀器有限公司；04711-45型超聲波破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1發酵培養方法

種子培養：將斜面菌樣接入裝有25 mL液體培養基的250 mL的三角瓶中，制備2瓶，在30℃、200 r/min搖床上培養12 h。后取6 mL菌樣接入裝有600 mL液體培養基的5 L的三角瓶中，在30℃、200 r/min搖床上培養12 h。

不同溫度下的分批發酵培養：滅菌前加入12 mL消泡油，初始pH值調節為7，滅菌后，將600 mL二級種子液接入裝有30 L液體培養基的50 L發酵罐中，控制適當的溫度，轉速設置為溶氧（30%～100%）轉速（200～480 r/min）聯動，當OD600nm約為2時，一次性加入配制好的0.1 g/mL的L-阿拉伯糖溶液300 mL發酵培養。

1.3.2分析測定方法

發酵過程中每2 h測一次OD600nm、氨基酸態氮、乙酸及酮基還原酶酶活。菌體量測定：發酵液用相應的培養基稀釋適當的倍數，振蕩混合搖勻后，用紫外可見光分光光度計測定波長600 nm處的光密度值（OD600nm）。酮基還原酶酶活測定：測定方法參考文獻［13］。發酵液氨基酸態氮測定：甲醛滴定法，參考文獻［14］。發酵液乙酸含量測定：測定方法參考文獻［15］。比生長速率μ為表征微生物生長速率的一個參數，其計算公式如下：

式中：μ為比生長速率，h-1；N1、N2分別為培養t時間前后微生物細胞量；t2、t1分別為培養時間，h。

2　結果與分析

2.1不同溫度下酮基還原酶分批發酵過程

不同溫度下發酵過程中OD600nm值、比生長速率、乙酸、酮基還原酶酶活以及轉速隨時間的變化趨勢結果分別見圖1～圖4。

圖1　不同溫度條件下OD600nm值及比生長速率在發酵過程中的變化Fig.1 Change of OD600nmand specific growth rate with fermentation time under different temperature conditions

圖2　不同溫度條件下氨基酸態氮含量在發酵過程中的變化Fig.2 Change of amino acid nitrogen content with fermentation time under different temperature conditions

圖3　不同溫度條件下乙酸含量和酮基還原酶酶活在發酵過程中的變化Fig.3 Change of acetic acid content and keto-reductase activity with fermentation time under different temperature conditions

圖4　不同溫度條件下轉速在發酵過程中的變化Fig.4 Change of rotate speed with fermentation time under different temperature conditions

由圖1可知，當溫度控制相對較低時（27℃、30℃），前期細胞生長的延滯期較長，菌體積累緩慢，菌體比生長速率相對于較高溫度變化更加平緩。當溫度逐漸提高時（33℃、37℃），細胞生長的延滯期逐漸縮短，2 h的菌體比生長速率逐漸提高，同時最大比生長速率也得到提高，細胞OD600nm達到40左右的時間逐漸縮短。整體來看，不同溫度下的OD600nm積累趨勢大致相似，37℃為菌體最佳生長溫度。

由圖2可知，菌體對氨基酸態氮的利用趨勢大體相似，都是先降低后平穩。較高溫度（33℃、37℃）下的氨基氮利用較快，與此條件下菌體生長較快表現一致。不同溫度下氨基酸態氮的最終利用限度相同，與菌體后期大致相同的OD600nm趨勢相吻合。

由圖3可知，乙酸含量在低溫（27℃、30℃）條件下由于比生長速率較低，溶氧供給充足，乙酸積累期滯后且乙酸積累量不高，最高分別為2 254 mg/L和3 641 mg/L。較高溫度（33℃、37℃）條件下，由于菌體代謝旺盛，溶氧不足，乙酸出現了大量積累，37℃達到了5 039 mg/L。

由圖3還可以看出，不同的溫度下，酶活的積累有顯著差異。較低溫度（27℃、30℃）條件下，隨著溫度的升高，酶活逐漸提高，30℃條件下12h酶活達到了較高值92.4U/mL，但是酶活在發酵后期出現了比較明顯的下降。提高溫度到37℃后時，最高酶活達到了157.5 U/mL，而且最高產酶時間也提前到了10 h。但是，所有溫度下的酶活，都在發酵后期出現了或多或少的下降。

由圖4可知，較低的溫度（27℃、30℃）條件下，由于溶氧消耗較慢而使得轉速提升期較慢，4 h之后才開始上升。較高的溫度（33℃、37℃）條件下，由于代謝旺盛而導致溶氧消耗迅速，2 h就出現了轉速上升。當轉速達到480 r/min后（該型發酵罐可長期正常工作的極限轉速），轉速不再增加，菌體代謝旺盛使得溶氧維持了相當長時間的較低水平。當培養基營養物質耗盡時，菌體代謝速率迅速下降，溶氧回落，轉速也相應降低。27℃轉速回落滯后可能是溫度過低營養物質利用相對緩慢，使溶氧長時間較低引起的。

綜上所述，溫度對于微生物的新陳代謝影響是不可忽略的。大腸桿菌的通常最適生長溫度為37℃，較高的溫度可能不利于異源蛋白的大量表達而容易形成包涵體。同時，過快的比生長速率容易形成乙酸，乙酸超出閥值5 000 mg/L將嚴重抑制菌體生長和產酶［16］。另外，菌體細胞發酵后期質粒的穩定性也是值得考慮的問題。關于菌體最適生長條件和產酶條件的差異，隨著外源酶的不同而不同，酮基還原酶為含（β/α）8-barrel結構的單體蛋白［17］，與大腸桿菌自身的很多氧化還原酶結構類似，37℃的最適生長溫度為最適產酶溫度也剛好證明了這一點，敬科舉等［18］也得出了另外一種還原酶在37℃催化活性最好的結論。所有發酵溫度條件下，發酵后期酶活都出現了下降，表明由溫度變化造成的質粒穩定性改變并非主要的影響因素。發酵在線參數顯示（圖4），乙酸利用完畢后營養物質缺乏，菌體對溶氧的需求減少，溶氧轉速聯動的調控設置造成所有溫度批次的轉速都從最大值480 r/min下降到約200 r/min左右。轉速的改變造成了流場環境的極大變化，某些影響產酶的未知因素（如蛋白水解酶［19］）可能也出現了變化，菌體甚至會重新調整以便適應新的環境，此時即使溶氧維持相對恒定，也無法保證脆弱的外源蛋白酶持續大量表達了。

2.2不同轉速下的酮基還原酶分批發酵過程

為了驗證轉速的改變對發酵后期酮基還原酶酶活是否有顯著影響，設計了不同轉速下的分批發酵實驗。發酵溫度設置為優化后的37℃，并依次設置了200 r/min、300 r/min、400 r/min、480 r/min等幾個恒定的轉速條件進行發酵，不同轉速條件下OD600nm值、比生長速率、氨基酸態氮、乙酸及酮基還原酶酶活在發酵過程中變化結果見圖5和圖6。

由圖5可知，低轉速條件（200 r/min、300 r/min）下的發酵20 h的最終OD600nm分別為16和28左右，這表明菌體最終沒有完全利用完培養基中的營養物質。400 r/min條件下的轉速比較適合對數生長期菌體積累的，但是在8 h到12 h菌體代謝切換的關鍵時期，溶氧不足導致菌體代謝和產酶受到了一定的影響。菌體對氨基酸態氮的利用水平也驗證了菌體的生長情況，200 r/min、300 r/min條件下的氨基酸態氮都未得到充分利用，最終仍維持在較高的水平。只有400 r/min以上較高的轉速下，菌體才比較充分地利用了培養基中的氨基酸態氮用于菌體的生長。

圖5　不同轉速條件下OD600nm值和氨基酸態氮含量在發酵過程中的變化Fig.5 Change of OD600nmand amino acid nitrogen content with fermentation time under different rotate speed conditions

圖6　不同溫度條件下乙酸含量和酮基還原酶酶活在發酵過程中的變化Fig.6 Change of acetic acid content and keto-reductase activity with fermentation time under different rotate speed conditions

由圖6可知，溶氧的缺乏所導致的乙酸積累。在200r/min、300 r/min條件下，積累的乙酸由于營養過剩無法被當做營養物質利用消耗，加上后期溶氧不足以維持較高濃度菌體代謝的需要，使得乙酸積累不斷增加。400 r/min以上轉速條件下，溶氧相對充足，菌體在碳源消耗完畢的同時，利用乙酸當碳源進行了二次生長。相對于400 r/min，由于480r/min條件下提供的溶氧更加充足，乙酸消耗的也更快，但最后都維持在了1 300 mg/L。

同時，圖6也顯示，低轉速條件下由于各種限制因素，導致酶活較低，300 r/min條件下出現了96.0 U/mL的較高酶活，但是之后酶活沒能繼續增加。低轉速條件由于菌體生長不好導致酶活不高，但是后期酶活的穩定也反映了轉速穩定對于酶活穩定的意義。400r/min條件下，出現了高于37℃溶氧轉速聯動條件下（157.5U/mL）的酶活185.5U/mL，而且酶活是隨時間持續增加的。在480 r/min最大轉速條件下，相比溶氧轉速聯動條件，10 h也達到了163.3 U/mL，酶活在發酵后期仍在不斷積累，發酵20h達到了217.1U/mL。

總的來說，在較高的恒定轉速（400 r/min、480 r/min）條件下，發酵后期酶活力的持續提升是顯而易見的。480r/min的酶活顯著高于400 r/min的酶活，說明除了溶氧，還存在影響菌體產酶的其他因素。轉速的變化影響的不僅僅是溶氧，還包括氣含率、傳質等眾多條件［20］，進而影響發酵的進程。目前的條件優化顯示，菌體的良好生長似乎更有利于酮基還原酶的產生，盡管菌體生長與產酶之間存在一個平衡。

3　結論

通過對酮基還原酶基因工程菌產酶進行梯度溫度優化設計，發現37℃為菌體最適產酶溫度，然而發酵后期的酶活并不穩定。通過多參數分析，發現溶氧的控制策略可能并不是影響后期發酵的主要因素，反而造成了轉速的改變而影響了發酵流場環境。不同梯度的恒定轉速實驗證實了發酵后期轉速的重要作用，最佳轉速為480 r/min，發酵20 h最大酶活優化到了217.1 U/mL。

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Optimization of culture temperature and rotate speed of Keto-reductase-producing genetically

ZHANG Song1，LI Xiao1，2*，SHI Xiaodan1，CHENG Ben2
（1.College of Biological and Pharmaceutical，China Three Gorges University，Yichang 443003，China；2.Angel Yeast Co.，Ltd.，Yichang 443003，China）

The effect of temperature（27℃，30℃，33℃，37℃）on the growth and enzyme production of keto-reductase-producing genetically engineered strain was investigated.Results showed that with the temperature increase within 37 ℃，the enzyme activity was improved and advanced，the maximum activity reached 157.5 U/ml at 37℃，10 h.But the enzyme activity in late fermentation phase was declined under all temperature conditions，maybe due to the declined rotation speed.Effect of different rotation speed（200 r/min，300 r/min，400 r/min，480 r/min）on fermentation was investigated at 37℃.The results showed that constant rotation speed had significant effect on the accumulation of enzyme，enzyme activity gradually increased with time at the speed of 480 r/min，and the enzyme activity reached 217.1 U/ml at 20 h.The optimum temperature and rotate speed for the fermentation of keto-reductase-producing genetically engineered strain was determined，and the results provided a guiding role to conduct further fed-batch fermentation of keto-reductase.

keto-reductase；temperature；rotate speed；enzyme activity

TQ920.6

0254-5071（2016）02-0079-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.018

2015-12-07

湖北省重大科技專項項目（2012ACA15）

張松（1991-），男，碩士研究生，研究方向為微生物發酵過程控制。

李嘯（1969-），男，副教授，博士后，研究方向為微生物反應過程的優化與控制。