蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料發酵條件的優化

黃永光，姜　瑩，周紀廷，趙辰路，周文美*（.貴州大學 白酒研究院，貴州 貴陽 55005；.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 55005）

蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料發酵條件的優化

黃永光1，姜瑩2，周紀廷2，趙辰路2，周文美2*
（1.貴州大學 白酒研究院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

以蕎麥和馬尾松花粉為原料，研制蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料。對5株酵母菌進行發酵試驗，以酒精度和總黃酮含量為評價指標，篩選出優良酵母；在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對料液比、發酵溫度、發酵時間3個主要因素進行優化。結果表明，選擇安琪甜酒干酵母為發酵菌種，最佳發酵工藝參數為料液比1∶6（g∶mL）、發酵溫度28℃、發酵時間7 d。在此最優發酵條件下制得的蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度為6.2%vol，總黃酮含量為92.92 μg/mL。

蕎麥；馬尾松花粉；發酵工藝；格瓦斯飲料

蕎麥和馬尾松花粉都為我國西南地區的特色資源。研究表明，蕎麥營養豐富，其中蛋白質和維生素B1、B2含量較高，干粉中含有約65 mg/kg的蘆丁，而蘆丁能夠影響胰島細胞的功能，促進胰島素的分泌，從而降低血糖；同時，可以調節血壓、強化血管，對腦溢血、網膜出血等有一定的預防、治療作用［1］；所含的可溶性膳食纖維約占膳食纖維總量的20%～30%，具有降低血清總膽固醇及低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）含量的作用［2］。馬尾松花粉藥食兼用的歷史在中國已逾數千年［3-4］，被營養學界譽為“完全營養源”［5］，被廣泛應用于藥品、保健品等領域，其具有抗氧化［6］、調節血脂［7］等功能。馬尾松中所含的植物甾醇具有降低機體膽固醇含量的功效，在功能性食品中應用廣泛，具有很高的應用價值。

格瓦斯飲料口感與外觀特性介于啤酒與碳酸飲料之間，既保存了啤酒豐富的泡沫與營養價值，又不會在人體內產生酒精作用，同時，既具備了碳酸飲料清爽的口感，又不會損壞身體健康，是一款極佳的酒類、碳酸飲料的替代飲料。傳統的格瓦斯飲料采用俄式面包發酵而成，工藝較為復雜，且飲料成本較高；現代食品技術采用類似于啤酒發酵的方法生產格瓦斯飲料，但降低了格瓦斯飲料的口感與風味。市面上的格瓦斯口味較為單一，除了原味格瓦斯外，只有蜂蜜格瓦斯以及小米、黑米、玉米格瓦斯幾種較為單一的口味。格瓦斯飲料的宣傳中側重于格瓦斯飲料的健康性與保健性，但由于格瓦斯飲料目前發展單一，既不利于提高格瓦斯的健康性，也對于格瓦斯飲料擴大受眾群體較為不利。因此，未來格瓦斯飲料的發展應面向產品口味多元化，提高飲料健康性。采用更為豐富的原料進行格瓦斯生產，同時，在保證傳統格瓦斯焙烤香、麥芽香的風味下，簡化格瓦斯飲料生產工序。

本研究以甜蕎麥、苦蕎麥、大麥為原料，根據單因素試驗結果，進行正交試驗，確定最優發酵條件。并與松花粉這種對人體更加有益的原材料相搭配，開發一款除保留傳統格瓦斯焙烤香與麥芽香外，同時融合了天然馬尾松花粉清香的格瓦斯飲料。并且蕎麥中的黃酮和馬尾松花粉中的可溶性多糖豐富了格瓦斯飲料的營養成分，在格瓦斯飲料中添加了新的健康理念。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

苦蕎麥：貴州師范大學生物育種研究室提供；中溫7658淀粉酶（2 000 U/g）：北京東華強盛生物有限公司；糖化酶（50 000 U/g）：湖南省津市新型發酵有限責任公司；甜蕎麥、大麥、食醋、丹寶利活性干酵母、安琪活性干酵母、發利活性干酵母、安琪葡萄酒果酒專用酵母、安琪釀甜酒干酵母均為市售；蘆丁標準品（分析純）：貴州迪達生物有限責任公司。

1.2儀器與設備

LK-1000A中藥粉碎機：四川江陽粉碎設備有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學儀器廠；722s可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；80-2離心機：上海浦東物理光學儀器廠；LDZX-40AI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；手持糖度計、手持酒精計：北京華運安特科技有限責任公司。

1.3試驗方法

1.3.1蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料制作工藝流程及操作要點［8-12］

蕎麥→去雜→洗凈→浸泡→種子萌發→烘干→粉碎→原料調配→液化→糖化→接種酵母→發酵→酒液分離→風味調配→澄清→灌裝→滅菌→成品

操作要點：

種子萌發：用清水將甜蕎麥和苦蕎麥洗凈，清水浸泡24 h，瀝干后平鋪于盤中，于25℃培養箱中培養3 d。

粉碎：發芽后的種子置于60℃鼓風干燥箱中干燥24 h，然后粉碎，過40目篩。

原料比例調配：甜蕎麥芽、苦蕎麥芽、大麥芽按照1∶2∶1的比例進行混合。

馬尾松花粉破壁：將馬尾松花粉按料液比1∶20（g∶mL）加水，在60℃、300 W超聲條件下，進行25 min破壁處理。

液化方法：在調配好的麥芽中加入一定量的無菌水，然后加入0.5%的淀粉酶，85～90℃水浴30 min。

糖化方法：將液化好的麥芽降溫至60℃，調節pH值為3.5，添加4%的糖化酶、60℃水浴中保溫40 min。

酵母活化：取一定量的活性干酵母，加入25倍活性干酵母量的5%葡萄糖溶液中，45℃水浴中活化40 min。

發酵：在糖化后的麥芽中添加0.5%酵母菌，按照一定量料液比在適宜的溫度下進行發酵。

酒液分離：將發酵后的酒液放入離心管中，3 000 r/min離心30 min。

風味調配：在發酵液中加入一定量的蔗糖、檸檬酸和破壁后的馬尾松花粉進行風味調配。

澄清：加入0.6 g/L高效飲料澄清劑，靜置2 h。

灌裝：將澄清部分的酒液進行灌裝。

巴氏殺菌：在65～70℃條件下保溫12～15 min。

冷卻：將滅菌后的產品放置室溫條件下進行降溫。

1.3.2菌種的選擇

選用安琪活性干酵母、安琪甜酒干酵母、發利活性干酵母、安琪葡萄酒果酒專用酵母、丹寶利活性干酵母5種菌種按照上述方法進行發酵試驗。發酵條件為甜蕎麥芽、苦蕎麥芽、大麥芽按照1∶2∶1的比例進行混合，在料液比1∶5（g∶mL）、菌種添加量為0.5%（以原料干質量計，下同）、發酵時間為7 d、溫度28℃條件下發酵。分別測定5種菌種發酵所得蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度、總黃酮含量，篩選發酵性能良好的菌株。

1.3.3單因素試驗設計

稱取20 g調配好的麥芽（甜蕎麥芽∶苦蕎麥芽∶大麥芽= 1∶2∶1），按照1.3.1的方法對麥芽進行液化、糖化后，添加0.5%安琪甜酒干酵母，考察料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g∶mL））、發酵溫度（24℃、26℃、28℃、30℃、32℃）、發酵時間（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）對蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量的影響。

1.3.4正交優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選用酵母發酵菌種，以蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度、總黃酮含量為評價指標，采用正交試驗對料液比（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）進行優化，最終確定蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的最佳發酵條件。正交試驗設計因素與水平見表1。

表1　發酵工藝條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5分析測定方法

總黃酮化合物含量的測定：采用分光光度計法［13］。

蘆丁標準溶液的配制：精確稱取蘆丁標準品0.030 0 g，置于100 mL容量瓶中，用體積分數為30%的乙醇溶液定容至刻度，得到0.3 mg/mL的標準溶液。

分別取上述蘆丁標準液0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL至50 mL容量瓶中，加入l.4 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置5 min后，加入1.4 mL 10%硝酸鋁溶液，振蕩搖勻靜置20 min后，加入10 mL l mol/L氫氧化鈉溶液，搖勻后，用體積分數30%乙醇溶液稀釋至刻度，靜置20 min后于波長510 nm處測定吸光度值［14］，以蘆丁質量濃度為縱坐標，吸光度值為橫坐標，繪制標準曲線圖。按照標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮的含量。

酒精度的測定：采用酒精度計法［15］。

2　結果與分析

2.1發酵菌種選擇

選用安琪活性干酵母、安琪甜酒干酵母、發利活性干酵母、安琪葡萄酒果酒專用酵母、丹寶利活性干酵母5種菌種進行發酵試驗，測定5種菌種發酵所得蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量，結果見表2。

表2　5菌種發酵液中酒精度和總黃酮含量的影響Table 2 Effect of five kinds of strains on alcohol content and total flavonoids content in the fermented liquid

由表2可知，在相同試驗條件下，安琪甜酒曲的活性最高，酒精度為5.1%vol，總黃酮含量為81.986 μg/mL。因此，選用安琪甜酒干酵母為發酵菌種。

2.2蘆丁標準曲線的建立

以空白作為參比，根據標準溶液吸光度值，以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖1。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1得到標準曲線回歸方程為：y=0.009 7x+0.001 8，相關系數R2=0.999 2。由此可見，蘆丁的質量濃度與吸光度值呈現良好的線性關系。

2.3單因素試驗結果分析

2.3.1料液比對酒精度、總黃酮含量的影響

考察不同料液比對蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量的影響，其結果見圖2。

圖2　料液比對蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料酒精度（A）和總黃酮含量（B）的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on alcohol content（A）and total flavonoids content（B）in buckwheat-masson pine pollen beverage

由圖2（A）可知，隨著料液比的增加，發酵液中酒精度呈現先增大后減小的趨勢，料水比較低時，發酵液黏稠度過高，導致發酵液發酵不充分，因此發酵液酒精度較低。當料液比為1∶6（g∶mL）時，發酵液中酒精度最大，為5.3%vol。當料液比較高時，由于發酵液稀釋，導致酒精度含量降低。由圖2（B）可知，隨著料液比的增加，發酵液中總黃酮含量先增加后減少，當料液比為1∶6時，發酵液中總黃酮含量達到最大值，為87.936 μg/mL；當料液比＞1∶6（g∶mL）時，由于發酵液稀釋，含水量高，發酵液中總黃酮含量降低。因此，綜合考慮，選擇料液比為1∶5～1∶7（g∶mL）進行后續試驗。

2.3.2發酵溫度對酒精度、總黃酮含量的影響

考察不同發酵溫度對蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量的影響，結果見圖3。

由圖3（A）可知，當溫度＜28℃時，酒精度較低，這是由于溫度低時，酵母菌活性較低，導致發酵不完全；當發酵溫度為28℃時，發酵液的酒精度最高，為4.8%vol；當溫度＞28℃時，酵母菌活性受到抑制，使酒精度降低。由圖3（B）可看出，隨著發酵溫度的升高，總黃酮含量逐漸增加，當發酵溫度為30℃時，發酵液中總黃酮含量最高，為86.446 μg/mL；再繼續升高發酵溫度，總黃酮含量開始下降。因此，綜合考慮，選擇發酵溫度為28～32℃進行后續試驗。

圖3　發酵溫度對蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料酒精度（A）和總黃酮含量（B）的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content（A）and total flavonoids content（B）in buckwheat-masson pine pollen beverage

2.3.3發酵時間對酒精度、總黃酮含量的影響

圖4　發酵時間對蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料酒精度（A）和總黃酮含量（B）的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content（A）and total flavonoids content（B）in buckwheat-masson pine pollen beverage

考察不同發酵溫度對蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的酒精度和總黃酮含量的影響，結果見圖4。

由圖4（A）可知，隨著發酵時間的延長，發酵液中的酒精度逐漸升高，當發酵至第6天時，發酵液中酒精濃度趨于平緩，發酵至第8天時，酒精度達到最大值，為4.2%vol；繼續發酵，酒精度略有降低，這是由于發酵液中酒精轉化為酸，使得發酵液酸度增加；由圖4（B）可知，隨著發酵時間的延長，發酵液中總黃酮含量迅速增加后趨于平緩，當發酵至第7天時總黃酮含量達到最高，為86.759 μg/mL，繼續發酵，總黃酮含量變化不大，因此，綜合考慮，選擇發酵時間為6～8 d進行后續試驗。

2.4正交試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上，對料液比、溫度、發酵時間3個因素進行正交試驗優化，正交試驗結果與分析見表3，方差分析結果見表4、表5。

表3　發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表4　以酒精度為評價指標正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using alcohol content as evaluation index

表5　以總黃酮含量為評價指標正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results using flavonoids content as evaluation index

由表3結果可知，以酒精度為評價指標，對酒精度結果影響的因素順序為發酵時間＞料水比＞發酵溫度，最佳工藝參數組合為A2B1C2；以總黃酮含量為評價指標，對總黃酮含量影響的順序為發酵溫度＞發酵時間＞料水比，根據極差R的大小可知，最佳工藝參數組合為A2B1C2。由表4、表5方差分析可知，以酒精度為評價指標時，發酵時間與料液比達到極顯著水平（P＜0.01），發酵溫度達到顯著水平（P＜0.05），以總黃酮含量為評價指標時，發酵時間、發酵溫度、料水比均達到顯著水平（P＜0.05），與極差分析相符合，因此，選擇最佳工藝參數組合為A2B1C2，即料水比1∶6（g∶mL），發酵溫度為28℃，發酵時間為7 d。在此最佳發酵條件下進行驗證試驗，酒精度為6.2%vol，總黃酮含量為92.916 μg/mL。由此可見，優化蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料的工藝是切實可行有效的。

3　結論

本研究以蕎麥和馬尾松花粉為原料，選用安琪甜酒活性干酵母為發酵菌種，制作蕎麥-馬尾松花粉飲料。在單因素的基礎上，采用正交試驗對該飲料的發酵工藝進行優化。結果表明，最佳發酵工藝參數為料液比1∶6（g∶mL）、發酵溫度28℃、發酵時間7 d，在此最佳工藝條件下，所得蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料中酒精度為6.2%vol，總黃酮含量為92.916 μg/mL。飲料顏色呈金黃略偏黃綠色，具有濃郁的麥芽香氣，甜度較高。

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Optimization of fermentation conditions of KbaC beverage with buckwheat-masson pme pollen

HUANG Yonghuang1，JIANG Ying2，ZHOU Jiting2，ZHAO Chenlu2，ZHOU Wenmei2*
（1.Institute of Liquor，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.GuizhouProvince Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Using buckwheat as raw material，the KbaC beverage was developed.The superior yeasts were screened from fine yeasts with alcohol content and total flavonoid content as evaluation index.On the basis of single factor experiments，three main factors including solid to liquid ratio，fermentation temperature and time were optimized by orthogonal experiments.Results showed that angel liqueur dry yeast was selected as the fermentation strain.The optimum fermentation technical parameters were as follows∶solid to liquid ratio 1∶6（g∶ml），fermentation temperature 28℃，fermentation time 7 d.Under the optimum fermentation conditions，the alcohol content and total flavonoid content of buckwheat-masson pine pollen KbaC beverage obtained were 6.2%vol and 92.92 μg/ml，respectively.

buckwheat；masson pine pollen；fermentation technology；KbaC beverage

TS261.9

0254-5071（2016）02-0061-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.014

2015-11-04

貴州省科技廳重大專項（黔科合重大專項字［2012］601-5號）；貴州省科技計劃（黔科合農G字［2015］4003號）

黃永光（1976-），男，研究員，博士，研究方向為白酒微生物及酒類食品安全。

周文美（1964-），女，教授，碩士，研究方向為生物化學及食品生物技術。