鼠李糖乳桿菌及枯草芽孢桿菌發酵對飼料品質的影響

謝全喜，亓秀曄，徐　輝，于佳民，徐海燕，谷　?。ㄉ綎|寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

鼠李糖乳桿菌及枯草芽孢桿菌發酵對飼料品質的影響

謝全喜，亓秀曄，徐輝，于佳民，徐海燕，谷巍
（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

該研究通過測定發酵飼料pH值、活菌數、乳酸含量及中性蛋白酶活性，篩選出適宜基礎飼料發酵的鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）BLCC2-0038和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BLCC1-0281，并對篩選出的鼠李糖乳桿菌和枯草芽孢桿菌進行單菌及混菌發酵方式進行了研究。結果表明，BLCC2-0038單獨發酵72 h時pH值降至3.73，活菌數達到7.05×109CFU/g，乳酸含量為48.67 mg/g；BLCC1-0281單獨發酵72 h時，活菌數達到2.28×1010CFU/g，中性蛋白酶活性達到3 207 U/g；BLCC2-0038和BLCC1-0281混菌發酵時，以鼠李糖乳桿菌/枯草芽孢桿菌配比為3∶1，2%接種量，有氧發酵方式最優，發酵72 h時鼠李糖乳桿菌活菌數為5.35×109CFU/g，枯草芽孢桿菌活菌數為7.80×109CFU/g，中性蛋白酶活性為1 407.83 U/g。

鼠李糖乳桿菌；枯草芽孢桿菌；發酵飼料；乳酸；中性蛋白酶；有氧發酵

飼料資源短缺問題長期制約著我國畜牧業的發展，尤其是蛋白飼料的嚴重不足已經成為全球性問題。發展高效飼料工業，提高糧食向畜牧產品轉化效率和飼料利用率、開發新型飼料原料是滿足畜牧業發展的最佳途徑［1-2］。利用微生物發酵技術來開發新型飼料資源越來越受到人們的重視。微生物發酵飼料作為一種綠色、環保型飼料，已經成為當今動物營養研究的熱點，同時也是綠色飼料的一個重要的發展方向。

微生物發酵飼料是指在人為可控制的條件下，利用乳酸菌、芽孢桿菌等有益菌種，對農業和輕工業生產的各種副產物進行發酵降解，降低pH值，減少有害菌的繁殖，產生乳酸等有機酸和中性蛋白酶等活性物質，改善飼料適口性，提高飼料利用率，是一種營養豐富、有益活菌含量高的生物飼料或飼料原料［3-7］。目前對發酵飼料的研究主要集中在發酵產品對畜禽生長性能及免疫水平影響等方面［8-11］，而對影響發酵飼料品質的菌種、發酵方式、生產工藝條件等研究相對較少。本試驗旨在研究適宜妊娠母豬全價飼料發酵的芽孢桿菌、乳酸桿菌的篩選和發酵方式對發酵飼料pH、活菌數、乳酸含量及中性蛋白酶活性的影響，為乳酸桿菌和芽孢桿菌發酵全價飼料提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1發酵基料

玉米-豆粕型配合飼料：山東泰安普瑞納飼料有限公司。

1.1.2發酵菌種及培養基

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）BLCC2-0038、BLCC2-0001、BLCC2-0111、BLCC2-0015和BLCC2-0112；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BLCC1-0281、BLCC1-0297、BLCC1-0169和BLCC1-0390均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

MRS培養基：葡萄糖2.0%、檸檬酸銨0.2%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸錳0.02%、硫酸鎂0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、吐溫-80 0.1%、pH 6.0。

酵母膏蛋白胨培養基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、酵母膏0.5%、pH 7.0。

1.1.3化學試劑

磷酸氫二鉀（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；硫酸鎂（分析純）、硫酸錳（分析純）：濟南匯豐達化工有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津凱通化學試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；檸檬酸銨（分析純）：上海撫生實業有限公司；乙酸鈉（分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母膏（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：山東祥瑞藥業有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1種子液制備

（1）芽孢桿菌種子液制備

取經過兩次活化的斜面菌種一環約0.05 g于裝有100 mL酵母膏蛋白胨培養基的500 mL三角瓶中，于37℃、180 r/min搖床培養24 h，待用。

（2）乳酸桿菌種子液的制備

取經過兩次活化的斜面菌種一環于裝有100 mL乳酸菌培養基的鹽水瓶中，于37℃靜置培養24 h。

1.2.2試驗設計

（1）乳酸桿菌的篩選

稱取一定量的基料按料水比1∶0.8（g∶mL）配制好，裝袋，裝袋量為100 g/袋，每個樣品設3個平行，分別按照2%接種量接入培養好的乳酸桿菌種子液，以不接種任何菌株的空白料為對照，壓實后于37℃培養箱進行生料厭氧發酵，分別于發酵24 h、48 h和72 h取樣，測定pH值、活菌數和乳酸含量。

（2）芽孢桿菌的篩選

稱取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比為1∶0.8（g∶mL），裝量50 g/瓶，121℃滅菌20 min后取出，使其自然冷卻，當溫度降至40℃左右時按2%接種量分別接入培養好的芽孢桿菌種子液，每個樣品設3個平行，以不接種任何菌株的空白料為對照，均置于37℃培養箱進行需氧發酵，分別于發酵24 h、48 h和72 h取樣，測定中性蛋白酶活性和活菌數。

（3）乳酸桿菌和芽孢桿菌混合發酵

將上述篩選得到的乳酸桿菌和芽孢桿菌進行混合發酵，發酵方式為需氧發酵（料水比為1∶0.8（g∶mL），裝量50 g/瓶，121℃滅菌20 min后取出，使其自然冷卻，當溫度降至40℃接菌，按乳酸桿菌/芽孢桿菌為3∶1，接種量2%接種）、厭氧發酵（基料按料水比1∶0.8（g∶mL）配制好，裝袋，裝袋量為100 g/袋，生料發酵，按乳酸桿菌/芽孢桿菌為1∶1，接種量2%接種）和混合發酵（料水比為1∶0.8（g∶mL），裝量50 g/瓶，121℃滅菌20 min后取出，使其自然冷卻，當溫度降至40℃接入1%芽孢桿菌進行需氧發酵，15 h后接入1%乳酸桿菌裝袋再進行厭氧發酵），以不接種任何菌株的空白料為對照，分別于發酵24 h、48 h和72 h取樣，測定pH值、活菌數和中性蛋白酶活性。

1.2.3測定指標及方法

（1）1樣品pH測定

取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

（2）芽孢桿菌和乳酸桿菌數量的測定

準確稱取發酵飼料10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當稀釋度的樣品分別至NRS培養基和酵母膏蛋白胨培養基中，37℃培養24～48 h，根據菌落數計算樣品中乳酸桿菌和芽孢桿菌數量，結果用lg（CFU/g）表示。

（3）乳酸含量的測定

采用羥基聯苯比色法測定發酵飼料中乳酸含量［12］。

（4）中性蛋白酶活性的測定

取發酵飼料1.0 g，采用福林-酚試劑法測定樣品中中性蛋白酶活性。

中性蛋白酶酶活定義：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶），在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位，以U/g表示。

1.2.4數據分析

用SPSS13.0軟件對數據進行統計分析，結果用“平均值±標準差”表示。

2　結果與分析

2.1乳酸桿菌對發酵飼料品質的影響

表1　鼠李糖乳桿菌發酵對飼料品質的影響Table 1 Effect ofL.rhamnosusfermentation on feed quality

續表

由表1可知，24 h、48 h和72 h時，BLCC2-0038發酵飼料的pH值均最低，顯著低于其余各菌株（P＜0.05），且活菌數均最高，顯著高于其余各菌株（P＜0.05）；且BLCC2-0038發酵妊娠母豬全價飼料在72 h時pH值達到最低，為3.73，活菌數維持在較高活菌數水平，為70.5×108CFU/g。

24 h、48 h和72 h時BLCC2-0038乳酸含量均最高，顯著高于其余各菌株（P＜0.05）。72 h時BLCC2-0038發酵妊娠母豬全價飼料乳酸含量高達48.67 mg/g。綜合pH值、活菌數和乳酸含量，鼠李糖乳桿菌BLCC2-0038最適宜作為發酵妊娠母豬全價飼料的理想菌株。

2.2芽孢桿菌對發酵飼料品質的影響

由表2可知，24 h、48 h和72 h時，BLCC1-0281活菌數和中性蛋白酶活性均顯著高于其余3株芽孢桿菌（P＜0.05），在發酵72 h時，活菌數達到2.275×1010CFU/g，且中性蛋白酶活性達到3207U/g發酵飼料，說明芽孢桿菌BLCC1-0281最適宜發酵妊娠母豬全價飼料。

表2　枯草芽孢桿菌發酵對飼料品質的影響Table 2 Effect ofB.subtilisfermentation on feed quality

2.3乳酸桿菌和芽孢桿菌聯合發酵對飼料品質的影響

利用篩選得到的鼠李糖乳桿菌BLCC2-0038和枯草芽孢桿菌BLCC1-0281混合發酵妊娠母豬全價飼料，按照需氧發酵（乳酸桿菌/芽孢桿菌為3∶1，接種量2%接種）、厭氧發酵（乳酸桿菌/芽孢桿菌為1∶1，接種量2%接種）和混合發酵（先接入1%芽孢桿菌進行需氧發酵，15 h后接入1%乳酸桿菌裝袋再進行厭氧發酵），以不接種任何菌株的空白料為對照，考察混合發酵對飼料品質的影響，結果見表3。

表3　乳酸桿菌和芽孢桿菌混合發酵對飼料品質的影響Table 3 Effect ofL.rhamnosusandB.subtilis mixed fermentation on feed quality

由表3可知，厭氧發酵時24 h、48 h和72 h時取樣均未測定中性蛋白酶活性，枯草芽孢桿菌活菌數未計出，說明兩者厭氧發酵時枯草芽孢桿菌不能夠進行有效發酵；混合發酵時，24 h取樣pH值最低，顯著低于厭氧發酵和需氧發酵（P＜0.05），鼠李糖乳桿菌和枯草芽孢桿菌活菌均超過108CFU/g發酵料，且測得的中性蛋白酶活性為757.14 U/g發酵料，說明24 h時兩者混合發酵均能夠有效發酵；48 h和72 h樣品pH值較24 h有所降低，鼠李糖乳桿菌活菌數增加，說明乳酸菌繼續發酵，但枯草芽孢桿菌活菌數和24 h相比維持在相同水平，且中性蛋白酶活性有所降低，說明枯草芽孢桿菌沒有繼續發酵，這與混合發酵前期是需氧發酵，氧氣充足有利于枯草芽孢菌的生長，后期厭氧發酵，枯草芽孢桿菌由于缺氧停止發酵有關；需氧發酵時24 h、48 h和72h時鼠李糖乳桿菌和枯草芽孢桿菌活菌數均在109CFU/g發酵料水平，說明二者均能夠同時有效發酵，且48 h和72 h樣品酶活性較24 h有大幅度提高，說明枯草芽孢桿菌繼續發酵。因此，鼠李糖乳桿菌和枯草芽孢桿菌兩者接種比例為3∶1，接種量為2%，37℃需氧發酵至72 h時，鼠李糖乳桿菌活菌數為5.35×109CFU/g，枯草芽孢桿菌活菌數為7.80×109CFU/g，中性蛋白酶活性為1 407.83 U/g，此時兩者發酵效果較好。

3　結論

微生物發酵飼料是利用乳酸桿菌、芽孢桿菌等微生物的新陳代謝和繁殖菌體來生產的飼料，主要通過微生物的發酵作用來改變飼料的品質［13］，將原料中的抗營養因子分解或轉化，產生能被畜禽采食、消化、吸收，養分更高且無毒害作用的飼料原料［14］。微生物發酵飼料中含有大量的有益微生物菌群（乳酸桿菌、芽孢桿菌等），乳酸菌作為替代抗生素的新型飼料發酵劑，具有益生菌的效用，如維持腸道菌群平衡，提高動物機體免疫力，且具有無殘留、無毒害等優點［15］。同時，乳酸菌發酵飼料作為功能型飼料，具有酸香味、適口性好、飼喂簡便、消化率高和功效穩定等優勢，具有良好的生產和應用價值［16］。飼料發酵后產生的有機酸可促進礦物質的吸收利用。芽孢桿菌繁殖時會產生各種酶，如中性蛋白酶、淀粉酶等活性消化酶，促進了動物對飼料的消化和吸收。

本試驗對菌種庫保存的性能優良的乳酸桿菌和芽孢桿菌發酵玉米-豆粕型配合飼料，根據發酵后飼料pH、活菌數和中性蛋白酶活性能指標，篩選出適宜發酵的乳酸桿菌為鼠李糖乳桿菌BLCC2-0038，發酵72 h時pH值降至3.73，活菌數達到7.05×109CFU/g發酵料，乳酸含量為48.67mg/g；適宜發酵的芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌BLCC1-0281，發酵72h時，活菌數達到2.275×1010CFU/g，且中性蛋白酶活性達到3207U/g；篩選得到的乳酸桿菌和芽孢桿菌聯合發酵時，以乳酸桿菌和芽孢桿菌兩者接種比例為3∶1，接種量為2%，37℃需氧發酵72 h時乳酸桿菌活菌數為5.35×109CFU/g，芽孢桿菌活菌數為7.80×109CFU/g，中性蛋白酶活性為1 407.83 U/g，此時乳酸桿菌和芽孢桿菌能夠同時發酵。

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Effect of Lactobacillus rhamnosus and Bacillus subtilis fermentation on feed quality

XIE Quanxi，QI Xiuye，XU Hui，YU Jiamin，XU Haiyan，GU Wei
（Shandong BaoLai-LeeLai Bioengineering Co.，Ltd.，Taian 271000，China）

Bydetermination of fermented feed pH，viable count of bacteria，lactic acid content and neutral protease activity，theLactobacillus rhamnosus BLCC2-0038 andBacillus subtilisBLCC1-0281 that was suitable for basic feed fermentation were screened，and the fermentation conditions of single and double-strains were researched.Results indicated that at the condition ofL.rhamnosusBLCC2-0038 single strain fermentation for 72 h，the feed pH reduced to 3.73，the viable count reached to 2.28×1010CFU/g，and the neutral protease activity was 3 207 U/g.The optimum conditions for L.rhamnosusBLCC2-0038 andB.subtilisBLCC1-0281 double-strains fermentation（ratio 3∶1），aerobic fermentation，inoculum 2%，fermentation time 72 h.The viable count ofL.rhamnosusandB.subtiliswere 5.35×109CFU/g and 7.80×109CFU/g，respectively，and the neutral protease activity was 1 407.83 U/g.

Lactobacillus rhamnosus；Bacillus subtilis；fermented feed；lactic acid；neutral protease；aerobic fermentation

S816.6

0254-5071（2016）02-0053-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.012

2015-11-20

泰安市科技發展計劃（201540701）

謝全喜（1984-），女，副研究員，碩士，主要從事動物微生態制劑研發工作。