大豆酸乳發酵菌種的馴化及營養因子的研究

高　霄，陳　倩，蔣予箭（浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

大豆酸乳發酵菌種的馴化及營養因子的研究

高霄，陳倩，蔣予箭*
（浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

選擇保加利亞桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）作為發酵菌種，通過逐步提高牛奶中豆乳的比例對菌種進行馴化的方法和改變培養基中營養成分的含量，研究大豆酸乳發酵過程中酸度值和菌落總數的變化情況。結果表明，經過馴化后的保加利亞桿菌發酵大豆酸乳過程中，酸度值從37.5°T上升至40.0°T，活菌數量提高了0.5倍；經過馴化后的嗜熱鏈球菌發酵大豆酸乳過程中，酸度值從35.0°T上升至37.5°T，活菌數量提高了1.67倍；經過馴化后的混合菌種（保加利亞桿菌∶嗜熱鏈球菌比例為1∶1）發酵大豆酸乳過程中，酸度值從42.5°T升至48.5°T，活菌數量提高了1.85倍；5種營養因子對大豆酸乳酸度的提高作用順序為大豆肽＞氨基酸＞胡蘿卜汁＞低聚果糖＞西紅柿汁。

大豆；菌種馴化；營養因子；酸度；菌落總數

大豆作為我國的主要農作物之一，不僅產量高而且營養十分豐富，大豆進一步加工而制成的豆漿則作為中國傳統飲品，一直受到國人的喜愛，豆漿中富含植物蛋白和多種維生素（如維生素B1、B2和煙酸），還含有鐵、鈣等礦物質。利用豆漿發酵而成的酸豆乳，其營養成分更有益于人體吸收。豆乳發酵常用的菌種是保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilic），但是由于豆乳在發酵過程中容易受到菌種及發酵機制等的影響，直接影響酸豆乳產品品質，而且豆漿中可供發酵菌種利用的營養物質也相對較少，導致發酵的大豆酸乳酸度低、活菌數量較少，嚴重抑制了酸豆乳發酵。本研究通過逐步提高牛奶中豆乳的比例對菌種進行馴化的方法和改變培養基中營養成分的含量（添加西紅柿汁、胡蘿卜汁、低聚果糖、氨基酸、大豆肽5種營養因子），使菌種在發酵過程中逐漸適應環境的變化，為大豆酸乳發酵的優化提供一定的科學依據，從而提高酸豆乳產品品質。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆漿：祖明豆制品有限公司提供；脫脂乳粉、西紅柿、胡蘿卜：市售；大豆肽粉、復合氨基酸粉（含17種氨基酸）、低聚果糖（食品級）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilic）：哈爾濱美華生物技術股份有限公司。

M17固體培養基：南京森貝伽生物科技有限公司；酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉（均為分析純）、蔗糖（食品級）：鄭州瑞恒化工有限公司。

1.2儀器與設備

B-HS-900/900U無菌操作臺：蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；ZHG-9070A（S）干燥箱：江陰濱江醫療設備有限公司；ZNCL-BS數顯恒溫磁力攪拌器：九陽股份有限公司；ZNCL-BS酸度計：泰州市育才教學設備有限公司；XB10200D電子天平：梅特勒-托利多集團；44X3生物顯微鏡：上海光學儀器一廠；SPX-250B-Z恒溫培養箱：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1培養基制備

MRS固體培養基的制備：精確稱取葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸膏5 g、檸檬酸二銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g，量取吐溫80 mL、水1 L，121℃滅菌20 min。

脫脂乳培養基的制備：精確稱取脫脂乳粉11 g，加100 mL蒸餾水溶解，112℃滅菌15 min。

菌種馴化培養基的制備：豆漿與脫脂牛乳分別按照0∶10、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、0∶10（V/V）的比例進行混合，再分裝到50 mL錐形瓶中，112℃滅菌15 min。

1.3.2菌種的活化及復壯

菌種的活化：首先將干燥菌種進行脫脂乳活化，取1 mL脫脂乳梯度稀釋后在平板上進行涂布，挑選合適梯度的單菌落進行第三代劃線活化，觀察菌落的形態并制備發酵劑。然后將第三代平板單菌落接種到脫脂乳中，發酵至脫脂乳發生凝固時即可，此時的發酵劑為較好的發酵劑（酸度≥40°T）。

發酵劑制作過程：菌種培養物（5 mL脫脂乳/試管）→1%～2%母發酵劑（100 mL脫脂乳/小三角瓶）。

菌種的復壯：菌種的活性在馴化和發酵過程中不斷降低，在此過程中發酵性能的衰退導致乳清過多析出、酸度持續降低，而這種現象的消除需要對菌種進行復壯培養，即從發酵劑中挑取菌種進行平板涂布，37℃恒溫箱中連續培養48 h，再挑取單菌落進行染色鏡檢，觀察菌種形態是否發生變化。選擇較強壯的單菌落在液體培養基上進行培養，37℃恒溫箱中培養24 h，再進行平板涂布，挑取單菌落。如此重復2～3次，從液體培養基中接種適量菌液至脫脂乳培養基中，最后得到母發酵劑。

1.3.3菌種的馴化

采用增加牛乳中豆漿比例和傳代馴化兩種方法交疊對保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌進行馴化［3］。在牛奶與豆漿體積比10∶0的環境下接種菌種進行發酵，發酵成品作為菌種再接種至牛奶與豆漿體積比9∶1的環境下進行培養。依次調整牛奶與豆漿的體積比為8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10，單菌和混合菌均按照牛奶遞減的比例進行馴化。

梯度馴化過程中，每個梯度需要連續馴化2～3次，以驗證菌種連續傳代活性的強弱，如果菌種活性衰退，則及時進行菌種復壯。

1.3.4營養因子及大豆酸乳的制備

營養因子制備：分別稱取一定質量的氨基酸粉、大豆肽粉、低聚果糖配制不同質量分數（0.5%、1.0%、2.0%、 3.0%）的溶液；西紅柿、胡蘿卜軟化、去皮、榨汁過濾，再調配成固形物含量分別為0.5 °Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx。

大豆酸乳制備：調整豆漿中固形物含量至8%，添加蔗糖和營養因子，于90℃滅菌20 min，冷卻至45℃，分別接種保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和混合菌種（保加利亞桿菌：嗜熱鏈球菌比例為1∶1），分別于43℃發酵8 h，4℃后熟14 h，得到大豆酸乳成品。

1.3.5酸度測定及菌落計數

酸度測定按照國標GB5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》中方法進行，以滴定酸度（°T）表示。保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌及混合菌種菌落計數采用國標GB 4789.35—2010《乳酸菌檢驗》中方法進行。

1.3.6數據處理方法

采用Excel、Origin8.0進行數據處理。

2　結果與分析

2.1菌種馴化對發酵過程大豆酸乳酸度的影響

圖1　保加利亞桿菌（A）、嗜熱鏈球菌（B）及混合菌種（C）發酵大豆酸乳過程中的酸度變化Fig.1 Changes of acidity in soy yogurt fermented by L.bulgaricus（A），S.thermophilus （B）and double-strains（C）

利用1.3.3法對發酵菌種進行馴化，進而測定大豆酸乳發酵過程中保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌、以及馴化混合菌種（保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌按照1∶1比例接種）的酸度與對照組酸豆乳（未經過馴化的菌種）的酸度。結果如圖1所示。

由圖1可知，在整個發酵過程中大豆酸乳酸度呈上升趨勢。發酵前期酸度上升速度較快，菌種利用蔗糖并快速生長，代謝產酸使酸度上升。隨著菌種數量增多，可利用的營養物質減少，環境不利于菌種的生長，因此代謝產酸速度降低，酸度的上升速度變慢。

馴化與未馴化的單菌種與混合菌種發酵對大豆酸乳的酸度影響均較大，兩菌種經過馴化之后的最終酸度均增加。保加利亞桿菌經過馴化后發酵大豆酸乳的酸度從37.5°T上升至40°T。嗜熱鏈球菌經馴化作用后發酵的大豆酸乳的酸度由35°T上升至37.5°T；經馴化后，混合菌種發酵的大豆酸乳的酸度由42.5°T升至48.5°T。

2.2菌種馴化對發酵過程大豆酸乳菌落數量的影響

利用平板涂布法對大豆酸乳在發酵過程中乳酸菌菌落數量進行計數，結果如圖2所示。

由圖2可知，馴化后的單菌種與混合菌種發酵對大豆酸乳的菌種數量均有較明顯的增多。馴化后的嗜熱鏈球菌發酵大豆酸乳的活菌數量提高了1.67倍；馴化后的保加利亞桿菌發酵大豆酸乳的活菌數量提高了0.5倍；馴化的混合菌種發酵大豆酸乳的菌種數量提高了1.85倍，此時發酵大豆酸乳的菌落總數為3.7×109CFU/100 mL。在發酵初期，菌種利用蔗糖進行生長代謝，馴化菌種與未馴化菌種的數量增加并且增幅相差較小。發酵后期蔗糖被消耗完，未經過馴化的菌種無法很好的適應生長環境，生長減慢，馴化菌種逐漸適應了大豆酸乳的生長環境，因此可以持續生長增殖。

2.3營養因子對大豆酸乳發酵過程中酸度及菌種數量的影響

按照保加利亞桿菌∶嗜熱鏈球菌比例為1∶1接種，按照

1.3.4方法發酵大豆酸乳，測定發酵過程中酸度以及菌落數量的變化。

2.3.1西紅柿汁、胡蘿卜汁對大豆酸乳發酵過程中酸度及菌落總數的影響

西紅柿汁與胡蘿卜汁（固形物含量分別為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx），于90℃滅菌15 min，在豆漿中加入4%促營養因子并接種發酵，不添加營養因子的大豆酸乳作為空白對照組。分別在發酵過程中的2～8 h測定大豆酸乳的酸度及菌落總數的變化，結果如圖3、圖4所示。

圖2　保加利亞桿菌（A），嗜熱鏈球菌（B）及混合菌種（C）發酵大豆酸乳過程中菌落總數的變化Fig.2 Changes of total bacterial count in soy yogurt fermented by L.bulgaricus（A），S.thermophilus （B）and double-strains（C）

圖3　不同固形物含量的西紅柿汁對大豆酸乳酸度（A）及菌落總數（B）的影響Fig.3 Effect of different solid content of tomato juice on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

圖4　不同固形物含量的胡蘿卜汁對大豆酸乳酸度（A）及菌落總數（B）的影響Fig.4 Effect of different solid content of carrot juice on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

由圖3A及圖4A可知，加入營養因子后，菌種獲得了生長必需的一些營養因子，因此生長速率加快，代謝產酸能力增強。不同固形物含量的西紅柿汁與胡蘿卜汁對大豆酸乳的最終酸度均有提高作用。發酵后期菌種數量增多，可利用的營養物質開始減少，對照組的酸度明顯低于添加營養因子的大豆酸乳的酸度，到達發酵終點時，對照組大豆酸乳的酸度為47.5°T。西紅柿汁固形物含量為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx對應的大豆酸乳的酸度分別50°T、52.5°T、53.5°T、47.5°T；胡蘿卜汁固形物含量為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx對應的大豆酸乳的酸度分別為49.5°T、53.5°T、57.5°T、51°T。固形物含量不同的營養因子對大豆酸乳的酸度有不同影響，固形物含量為2°Bx時的西紅柿汁、胡蘿卜汁對酸度的提高作用最大，此時大豆酸乳的酸度分別為53.5°T、57.5°T。

由圖3B及圖4B可知，含有不同含量固形物的營養因子對菌落總數均有不同程度的提高作用。大豆酸乳在發酵過程中，發酵2h后對照組的活菌數量為1.2×108CFU/100 mL。西紅柿汁固形物含量為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx對應的菌種數量分別為1.3×108CFU/100mL、1.9×108CFU/100mL、2.76×108CFU/100 mL、1.9×108CFU/100 mL。胡蘿卜汁固形物含量為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx對應菌種數量為2.4×108CFU/100mL、2×108CFU/100mL、7.5×108CFU/100mL、1.95×108CFU/100 mL。不斷發酵過程中，菌種的生長速度逐漸下降，其中對照組的菌種生長速度下降最明顯，然而添加營養因子的菌種生長速度下降較慢，甚至還有小幅增長。發酵終止后，對照組的活菌數量為3.7×109CFU/100 mL；西紅柿汁、胡蘿卜汁固形物含量為2°Bx，活菌數量增加最多，分別為4.3×109CFU/100 mL、5.9×109CFU/100 mL，分別為空白組活菌數量的1.2倍和1.6倍。

2.3.2氨基酸、大豆肽、低聚果糖對大豆酸乳的酸度及菌落總數的影響

分別配制不同質量分數（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）的氨基酸、大豆肽、低聚果糖溶液，在豆漿中加入4%的營養因子溶液，接入菌種發酵，空白對照組不添加營養因子。分別在發酵過程中的2 h、3 h、4 h、6 h、7 h、8 h測定大豆酸乳的酸度變化及活菌數量，結果如圖5～圖7所示。

圖5　不同質量濃度的氨基酸溶液對大豆酸乳酸度（A）及菌落總數（B）的影響Fig.5 Effect of different content of amino acid solution on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

圖6　不同質量濃度的大豆肽溶液對大豆酸乳酸度（A）及菌落總數（B）的影響Fig.6 Effect of different content of soybean peptide solution on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

圖7　不同質量濃度低聚果糖溶液對大豆酸乳酸度（A）及菌落總數（B）的影響Fig.7 Effect of different content of fructooligosaccharide solution on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

由圖5A～圖7A可知，不同濃度的氨基酸、大豆肽、低聚果糖溶液對大豆酸乳發酵的酸度有提高作用。發酵結束后對照組的酸度為47.5°T，當添加氨基酸質量濃度為1.0%時，大豆酸乳酸度最高，酸度值為58.5°T；當添加大豆肽質量濃度為3.0%時，大豆酸乳酸度最高，酸度值為60°T；當添加低聚果糖質量濃度為2%時，大豆酸乳酸度最高，酸度值為55°T。

由圖5B～圖7B可知，3種營養因子的添加對活菌總數均有較明顯的提高作用。發酵結束時對照組的活菌總數為3.7×109CFU/100 mL，當添加氨基酸質量濃度為3.0%時，大豆酸乳活菌總數為8×109CFU/100 mL，是對照組的2.16倍；當添加大豆肽質量濃度為2.0%時，大豆酸乳活菌總數為6.83×109CFU/100mL，是對照組的1.85倍；當添加低聚果糖質量濃度為2.0%時，大豆酸乳活菌總數為7×109CFU/100mL，是對照組的1.89倍。

3　結論

菌種馴化對單菌、混合菌種發酵大豆酸乳的酸度及活菌總數均有明顯的增加作用。經過馴化后的保加利亞桿菌發酵大豆酸乳過程中，酸度值從37.5°T上升至40°T；經過馴化后的嗜熱鏈球菌發酵大豆酸乳過程中，酸度值從35°T上升至37.5°T；經過馴化后的混合菌種發酵大豆酸乳過程中，酸度值從42.5°T升至48.5°T。通過添加西紅柿汁、胡蘿卜汁、低聚果糖、氨基酸、大豆肽這5種營養因子均有效提高了菌種的生長速度，對發酵大豆酸乳的酸度、菌種總數均有所提高，其中這5種營養因子對大豆酸乳酸度的提高作用順序為大豆肽＞氨基酸＞胡蘿卜汁＞低聚果糖＞西紅柿汁。添加體積分數4.0%含量為3.0%大豆肽對大豆酸乳的酸度提高作用最為顯著，酸度值由47.5°T上升至60°T，活菌總數由3.7×109CFU/100 mL增加至6.83×109CFU/100 mL。

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Study on the domestication of fermentation strains and the nutrition factors of soybean yoghurt

GAO Xiao，CHEN Qian，JIANG Yujian*
（College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018，China）

UsingLactobacillus bulgaricusandStreptococcus thermophilusas fermentation strains，by gradually increasing the proportion of soybean milk in cow milk to domesticate strains and changing content of nutritional components in culture medium，the changes of acidity and total bacterial count during the fermentation process of soybean yoghurt were researched.The results showed that in the soybean yoghurt fermented by domesticatedL.bulgaricus，the acidity increased from 37.5°T to 40.0°T，the viable count was increased by 0.5 times.In the soybean yoghurt fermented by domesticatedS.thermophilus，the acidity increased from 35.0°T to 40.0°T，the viable count was increased by 1.67 times.In the soybean yoghurt fermented by domesticated mixed strains（L.bulgaricusandS.thermophilusratio1∶1），the acidity increased from 42.5°T to 48.5°T，the viable count was increased by 1.85 times.The improving effect of five kinds of nutritional factors on acidity of soybean yoghurt in order was soy peptide，amino acid，carrot juice，fructooligosaccharide，tomato juice.

soybean；strains domestication；nutritional factors；acidity；total bacterial count

TS252.54

0254-5071（2016）02-0034-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.008

2015-11-27

浙江省自然科學基金資助項目（LY12C20014）

高霄（1990-），女，碩士研究生，研究方向為現代食品加工。

蔣予箭（1963-），男，教授，本科，研究方向為現代食品加工。