熒光法測葉綠素在壓載水檢測中的應用及前景

李建誼， 張　波， 汪　璇

(1.上海歐陸科儀有限公司， 上海 201216； 2.河北海事局， 河北 秦皇島 066000； 3.上海船舶工藝研究所， 上海200032)

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熒光法測葉綠素在壓載水檢測中的應用及前景

李建誼1， 張波2， 汪璇3

(1.上海歐陸科儀有限公司， 上海 201216； 2.河北海事局， 河北 秦皇島 066000； 3.上海船舶工藝研究所， 上海200032)

熒光法是一種被行業公認的檢測壓載水中葉綠素含量最有效的方法，已被廣泛應用于壓載水檢測領域，此方法也顯示出了極大的發展前景和應用價值。提出了一種新型的葉綠素檢測儀器，經過一系列的試驗，驗證了此儀器的實用性、精確性和有效性。并分析了此技術的前景，為未來的發展提出了方向和展望。

熒光法葉綠素壓載水檢測

0　引言

由船舶壓載水攜帶的海洋物種對海洋環境的侵害被認為是海洋的四大危害之一。據估計，每年約有100億噸的壓載水在全球轉移，每天約有超過3 000種生物通過壓載水在全世界范圍內遷徙[1]。為此，國際海事組織(IMO)于2004年2月13日在倫敦通過了《國際船舶壓載水和沉積物管理與控制公約》，以更好地管理和控制壓載水的取排。該公約共有22條條款和一條規則附則，附則的D-2為壓載水性能標準，該標準對未來船舶排放壓載水中的活體生物數量做了明確規定[2]，如表1所示。

大洋水中主要的小型活體是微藻，而葉綠素α廣泛存在于所有的藻類中，通過對浮游植物葉綠素的測量可以得知有生產力的活體細胞豐度。浮游植物葉綠素α濃度的測定有多種方法，其中常用的有分光光度法、熒光光度法和高效液相色譜法(HPLC)[3]。高效液相色譜法能夠精確地測定各種光合色素的含量，但由于儀器昂貴，分析操作步驟繁瑣，一般不能用于野外大量樣品的快速分析[4]。分光光度法最為常用，其測定儀器簡單，一般實驗室都有配備，且已具備完善的測定體系。這種方法得到的數據相對準確，但測試程序耗時，需要有經驗的分析人員操作，以確保良好的數據及長期的一致性，遺憾的是不能用于大量樣本的快速、實時監測[5]。熒光光度法作為微量分析的經典方法，能精確地測定葉綠素α的含量，其靈敏度是分光光度法的50倍以上, 且不需要萃取。 特別是脈沖幅度調制(PAM)熒光技術的出現，為葉綠素熒光的野外現場、原位測量提供了技術支持。PAM熒光技術還能測量植物在光合作用中葉綠素對光能的利用效率，進而可判斷植物細胞的活性，為分析壓載水中的微藻奠定了良好的基礎。PAM 脈沖幅度調制熒光技術信號原理如圖1所示。

表1　IMO D-2排放標準

圖1　PAM 脈沖幅度調制熒光技術信號原理

1　儀器開發

普通的葉綠素熒光測量多是在萃取液中進行(見圖2)。葉綠素α熒光在不同介質中激發與誘導出的波長會有所不同，其中紅色激發波長與誘導出的波長很接近。因此，如何有效地檢測水體中微藻的葉綠素α熒光微弱的信號，并且儀器體積小、方便現場使用，都是儀器開發者必須考慮的問題。

圖2　樣品池中飽和光通過樣品后激發出近紅熒光

儀器開發首先尋找、試驗葉綠素α在水體中的激發和發射波長，然后進一步優化有關光學器件，控制好激發與接受熒光的光譜帶寬以及截止深度，使到達接受器的是干凈的熒光，即不含有其它波長的干擾光。其次，篩選合適的接受器。接受器不僅要求靈敏度高，還要求響應時間短，以滿足PAM技術的需要。隨后采用可靠的前置光電轉化電路、濾波和鎖相放大技術將微弱的熒光有效地提取并轉化為電信號，經放大并濾去噪聲，成為平穩的直流信號。然后通過數模轉換器件轉化為數字信號送入單片機，再輔以軟件的數字濾波技術對數字信號進一步濾波降噪，得到穩定的信號值。最后通過測量已知濃度葉綠素α的熒光值建立起葉綠素α濃度與熒光值之間的關系，再配制不同濃度的葉綠素α溶液驗證儀器的準確度及線性。在儀器能夠準確測量葉綠素α濃度的前提下，直接測量水體中微藻，以嘗試利用葉綠素熒光法測量壓載水中的微藻。

2　儀器試驗

目前開發的便攜式快速檢測設施一般在船上、海上以及戶外使用，保證在測量范圍內其可靠性及重復性達到應用的要求。ET 1301是一臺防水(灑水) 、不用預熱、使用5號電池運作、受環境光線影響小、操作簡便的儀器。該儀器有多個模式, 包括可同時手動輸入水樣品的其他參數, 以便在之后的數據處理中有更完整的參數。針對活體藻細胞, 使用1 mm×1 mm的熒光比色皿, 但不要求嚴格的配對使用, 令測量的操作出錯機會更低。圖3為ET 1301便攜式葉綠素熒光儀。整個儀器可以放在手掌上操作。儀器表面有一個放置標準熒光比色皿的樣品室、操作鍵盤和顯示屏。操作時，可以在鍵盤上輸入并顯示日期等信息。測量葉綠素α的熒光值時，會顯示出葉綠素α的濃度和生產量，以及原始的熒光值Fo、Fm。另有校準功能供用戶定期檢查和標定儀器。

圖3　ET 1301便攜式葉綠素熒光儀

2.1葉綠素α標準品的檢測

將購得的葉綠素α標準品在弱光下小心地稱取1 mg，溶于100 mL 100%甲醇中，充分混勻后，得標準溶液濃度為10 mg/L，用鋁箔紙包覆以避光。

將標準溶液稀釋100倍，分別檢測在665.2 nm和652.0 nm的吸光度A665.2、A652.0，經公式Chl α= 16.29A665.2-8.54A652.0計算結果[6]，標定葉綠素α溶液濃度為98.22 μg/L。

將此溶液分別稀釋2、5、10、20、40、100、200、400、1 000倍，用ET 1301熒光儀檢測，結果如表2所示。

表2　葉綠素α標準品檢測結果

注：表中實測值為三次檢測后的平均值。

由表2可以看出，熒光法檢測葉綠素α濃度的準確度和靈敏度都很好。由于是標準品，本身并沒有葉綠素生產量，所以其實測數據都接近0。

2.2活藻的檢測

實驗樣品使用采購的單純原甲藻液，如圖4所示。圖中左側是活的甲藻，葉綠體仍有豐富的葉綠素；右側的是死亡的甲藻，體內的物質已基本分解。吸取0.5 mL注入計數板，在500倍的顯微鏡下觀察并計數。計數時不分是否存活，但不計算死亡后由于分解不含葉綠素的細胞。同時將原液按一定的比例稀釋，用已校準過的葉綠素熒光儀檢測其葉綠素的濃度和生產量，以觀察單一藻種的葉綠素濃度與個體之間的關系。所有操作過程中不使用固定劑。

圖4　測試水樣中的甲藻

由于微藻含量稀少，需多次取液觀察計數，取每次計數的平均值作為原液的原甲藻含量，約為5 560個/mL。以兩組不同的稀釋比例試驗，結果如表3所示。

表3　不同含量的原甲藻液與葉綠素濃度及其熒光值

表中原甲藻的含量由原液的含量按稀釋的比例計算而得，熒光值F0、Fm為儀器測量所得數據，葉綠素濃度和葉綠素生產量則是儀器由熒光值計算所得，其中儀器已自動扣除本身的本底值。

由表3的數據可知，葉綠素熒光值F0或葉綠素濃度與原甲藻的含量成較好的線性關系，其線性相關系數R2=0.9983，而葉綠素的生產量與原甲藻的含量基本沒有線性關系。

因此，對單一藻種而言，通過標定后的儀器直接檢測微藻的個數是可行的，且靈敏度高，能達到檢測近百個中型原甲藻數量。然而，表3的數據也說明，即使是單一的藻種，用葉綠素熒光技術直接檢測壓載水中低至10個/mL的微藻活體數量，還存在很大差距。

葉綠素生產量是葉綠素對光能量利用效率的表征，可間接表達微藻的活性，或微藻的活體量。葉綠素生產量與原甲藻含量沒有線性關系正說明了微藻活體量與微藻整體含量沒有關聯。

3　應用前景

應用葉綠素熒光技術可直接測量水體中微藻的含量, 無需萃取等樣品前處理過程。由于實際水體中含有各類藻種，且溫度、鹽度、光照等都會影響微藻生理狀況與葉綠素熒光及生產量，而葉綠素熒光法測量的是葉綠素濃度和生產量，不能給出各種微藻活體的數量，只能是一種半定量的方法。因此，單獨使用葉綠素熒光技術檢測水體中的微藻含量，具

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有一定的局限性，特別是微藻活體含量稀少至10個/mL以下的合格壓載水。然而，葉綠素熒光法作為高靈敏度、快速、簡便、無污染的檢測方法，若輔以采樣時的富集濃縮手段，對壓載水微藻含量的現場快速檢測仍具有參考價值，而濃縮所需要的水體量也顯著低于傳統分析方法所需要的水體量。ET1301便攜式葉綠素熒光儀設計體積小、操作簡單，使用電池供電、保證本質安全，沒有萃取、染色等前處理過程，可有效避免繁瑣的前處理過程可能產生的偏差，使用人員無需特別培訓即可操作，可攜帶上船直接測量，縮減了壓載水傳統分析方法的取樣時間和工作量及費用，對加快船舶的進出港運營和港口國檢查(PSC)的實施也有幫助。

D-2標準中關于浮游植物的指標檢測存在兩個問題：一方面，這兩個指標限值很低，必須采集大量的水樣，并對水樣進行濃縮，才能達到大多計數方法的檢測底限。另一方面，指標要求將壓載水中不同種類活體數量的總和計數出來，這意味著采用的計數方法不但需能區別不同種類的生物，且能區分不同種類生物的死活。此外，港口每天要靠港大量船舶，船舶的靠港費用昂貴，這就要求檢測耗時要盡可能短。而葉綠素熒光儀檢測具有操作簡單、樣品量小、靈敏度高、可直接用活體檢測的特點，在國際上已獲得越來越多的認可。

[1]黨坤，宋家慧，趙殿榮，等.船舶壓載水問題綜述[J]. 航海技術，2001(4)：60-63.

[2]廖銘勝. 《國際船舶壓載水和沉積物管理與控制公約》簡介[J].交通環保，2004，25(5)：48-50.

[3]Wetzel R G, Likens G E. Limnology：Lake and River Ecosystems, 3rd edition[M]. New York: Springer,2000.

[4]Jacobsen T R. Comparison of chlorophyll a measurements by fluorometric, spectrophotometric and high pressure liquid chromatographic methods in aquatic environment[J]. Ergebnisse Der Limnologie, 1982(16):35-45.

[5]張江龍. 葉綠素監測儀器在水質自動監測應用中的優劣淺析[J].現代科學儀器,2007(1):41-43.

[6]高坤山. 藻類固碳——理論、進展與方法[M]. 北京：科學出版社,2014.

Application and Prospect of Measuring Chlorophyll Using Fluorescence Method for Ballast Water Tests

LI Jian-yi1, ZHANG Bo2, WANG Xuan3

(1.Shanghai Euro Tech Co., Ltd., Shanghai 201216, China; 2.HEBEI Maritime Safety Administration of People’s Republic of China, Qinghuangdao Hebei 066000, China;3.Shanghai Shipbuilding Technology Research Institute, Shanghai 200032, China)

The widely used Fluorescence Method is considered as the most effective way to measure chlorophyll in ballast water test and it has tremendous development prospect and application value. A new kind of chlorophyll measurement equipment with practicability, precision and effectiveness after experimental verification was proposed. Prospect of the technology and comes up with the future development and expectation was analyzed.

Fluorescence MethodChlorophyllBallast waterTest

李建誼(1962-)，男，高級工程師，主要研究方向為儀器儀表技術。

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