XRCC1基因多態性對結腸癌患者術后FOLFOX4方案化療療效的影響

盧宏全　黃國定　林　影　潘敏麗

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XRCC1基因多態性對結腸癌患者術后FOLFOX4方案化療療效的影響

盧宏全黃國定林影潘敏麗

目的探討X射線交錯互補修復基因1(XRCC1) Arg399Gln基因多態性對結腸癌患者術后FOLFOX4方案化療療效的影響。方法113例結腸癌患者均接受根治術治療。術后采用焦磷酸測序法檢測腫瘤組織中的XRCC1 Arg399Gln基因多態性，并給予FOLFOX4方案化療6個周期。治療結束后對患者進行隨訪。結果⑴113例結腸癌患者的XRCC1 Arg399Gln位點包括Gln/Gln、Gln/Arg、Arg/Arg等3種等位基因型，其頻率分別為66.4%(75/113)、27.4%(31/113)、6.2%(7/113)。⑵Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組之間性別、年齡、病理類型、癌腫部位、腫瘤形態、TNM分期、T分期、癌胚抗原(CEA)相比差異無統計學意義(P>0.05)。⑶隨訪期內，Gln/Gln基因型組復發轉移率顯著低于非Gln/Gln基因型組，3年生存率顯著高于非Gln/Gln基因型組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論XRCC1 Arg399Gln基因多態性可以影響結腸癌患者術后FOLFOX4輔助化療的遠期療效。

X射線交錯互補修復基因1；基因多態性；結腸癌

(The Practical Journal of Cancer,2016,31:1239～1241)

以手術為主的綜合治療是目前臨床治療結腸癌的主要原則，FOLFOX4方案則是高危Ⅱ～Ⅲ期結腸癌患者術后輔助化療的標準方案，盡管如此，該方案的療效常受到多方面因素的影響[1]。X射線交錯互補修復基因1(XRCC1) Arg399Gln基因多態性是目前腫瘤學研究的熱點之一，諸多報道均認為它可以影響奧沙利鉑的抗腫瘤效果[2-4]。本研究即旨在探討其對結腸癌患者術后FOLFOX4方案化療療效的影響，現報告如下。

1　材料與方法

1.1研究對象

選取2009年7月-2012年5月海南省儋州市第一人民醫院收治的113例患者，其中男性65例、女性48例，年齡>50歲28例、≤50歲85例；病理類型：腺癌101例、黏液癌9例、未分化癌3例；癌腫部位：近端結腸47例、遠端結腸66例；腫瘤形態：腫塊型50例、浸潤型35例、潰瘍型28例；TNM分期：Ⅱ期31例、Ⅲ期82例；T分期：T1～T220例、T3～T493例；癌胚抗原(CEA)正常17例、升高96例。

1.2納入標準及排除標準

納入標準：⑴結腸癌根治術后取組織送檢，經病理組織學檢查確診；⑵術后接受FOLFOX4方案化療，化療周期數為6個；⑶符合結腸癌根治術的治療指征，臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期；⑷簽署知情同意書，經醫院倫理委員會批準。排除標準：⑴未接受XRCC1 Arg399Gln基因多態性檢測；⑵臨床資料收集不全；⑶隨訪丟失。

1.3XRCC1 Arg399Gln基因多態性檢測方法

1.3.1組織DNA提取包括去除石蠟、組織溶解、DNA柱分離等3個步驟。去除石蠟方法如下：⑴取1 ml 二甲苯置于EP管中，用二甲苯沖淋載玻片上的石蠟切片(片厚4 μm)，濕潤后用刀片刮取石蠟組織，二甲苯反復沖淋，將全部二甲苯液轉移至EP管中，共刮取2～4塊石蠟切片。⑵強力震蕩20 s，室溫下18 000 rpm離心3 min，棄上清。⑶加入1 ml無水乙醇，震蕩混勻，室溫下18 000 rpm離心3 min，棄上清。⑷乙醇提取重復1次。組織溶解方法如下：⑴加入180 μl 消化緩沖液、20 μl 蛋白酶K，震蕩混勻。⑵50 ℃水浴孵育3 h，室溫下18 000 rpm離心3 min，將上清移于另一支EP管。⑶加入20 μl 核糖核酸酶A，震蕩混勻，室溫孵育2 min。⑷加入200 μl 裂解/結合緩沖液，震蕩混勻。⑸加入200 μl 無水乙醇，震蕩混勻。DNA柱分離方法如下：⑴吸取組織溶解液，置于小柱中，室溫下18 000 rpm離心1 min。⑵更換收集管，向柱子中加入500 μl 緩沖液1，室溫下18 000 rpm離心1 min。⑶更換收集管，向柱子中加入500 μl 緩沖液2，室溫下18 000 rpm離心3 min。⑷將柱子置于EP管中，加入50 μl 洗脫緩沖液，室溫孵育1～5 min，室溫下18 000 rpm離心1 min。此時EP管中為gDNA，標記后-20 ℃保存。

1.3.2目的基因PCR片段擴增擴增引物包括XRCC1 25487-pyro BioF：CATCGTGCGTAAGGAGTGG；XRCC1 25487-pyro R：ATTGCCCAGCACAGGATAAG。PCR反應體系包括：dNTP 1.5 μl，10×PCR 緩沖液 5.0 μl，XRCC1 25487-pyro BioF 0.5 μl，XRCC1 25487-pyro R 0.5 μl，rTaq 0.5 μl，ddH2O 40.0 μl，gDNA 2.0 μl。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次，72 ℃終延伸5 min。

1.3.3測序樣本純化以及目的基因SNP檢測步驟如下：⑴在PSQ 96孔板中加入40 μl 退火緩沖液、3 μl 測序引物。⑵在925 μl 結合緩沖液中加入75 μl磁珠，震蕩混勻。⑶在96孔板中先后加入40 μl磁珠混合液以及等體積的PCR產物，封蓋，1 900 rpm 震蕩10 min。⑷在真空工作站中，4個樣品板分別加入180 ml高純水、120 ml 70%乙醇、變性緩沖液、沖洗緩沖液。⑸打開泵，在高純水中清洗柱頭30 s，將柱頭移至PCR板中抓取磁珠。⑹將柱頭置入70%乙醇中5 s，移至變性緩沖液中5 s，再移至沖洗緩沖液中5 s。⑺將柱頭置于Pyro反應板上方，將泵關掉。⑻將柱頭置于含有測序引物的板中，振動釋放磁珠，高純水清洗柱頭。⑼將放有樣品的PSQ 96孔板置于透明恒溫臺，加熱至80 ℃，2 min后冷卻至室溫，此時即可進行焦磷酸測序反應。⑽將PSQ 反應板、試劑倉置于測序儀中，點擊RUN鍵。

1.4統計學處理

采用SAS9.0統計軟件，計數資料百分率比較采用R×C表χ2檢驗，生存分析采用Log rank檢驗，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1基因型分布

113例結腸癌患者的XRCC1 Arg399Gln位點包括Gln/Gln、Gln/Arg、Arg/Arg等3種等位基因型，其構成比分別為66.4%(75/113)、27.4%(31/113)、6.2%(7/113)。

2.2Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組臨床資料指標的比較

Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組之間性別、年齡、病理類型、癌腫部位、腫瘤形態、TNM分期、T分期、CEA相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組遠期療效的比較

隨訪期內，Gln/Gln基因型組復發轉移率顯著低于非Gln/Gln基因型組，3年生存率顯著高于非Gln/Gln基因型組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

3　討論

結腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤之一。近20年來，其發病率在國內有明顯提高，尤其是在大城市，結腸癌有多于直腸癌的趨勢[5]。在結腸癌發生、發展過程中，遺傳突變包括癌基因激活、抑癌基因失活、基因過度表達、錯配修復基因突變等發揮了舉足輕重的作用。隨著研究的深入，遺傳突變與結腸癌患者預后的關系逐步得到重視。

表1　Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組臨床資料指標的比較/例

表2　Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組遠期預后的比較(例，%)

XRCC1是一個參與電離輻射所致DNA損傷修復的基因，該基因定位于19號染色體q13.2-q13.3，包含17個外顯子，編碼1個分子量為70 kD的蛋白質[6]。目前國內有關XRCC1 Arg399Gln基因多態性影響奧沙利鉑療效的研究主要集中在消化系統腫瘤。劉同欣等[3]報道，XRCC1 Arg399Gln基因多態性可以影響以奧沙利鉑為基礎的化療方案治療晚期胃癌患者的化療有效率、無疾病進展生存期(mPFS)、總生存期(MST)。吳云云等[4]報道，XRCC1 Arg399Gln基因多態性分布與結直腸癌患者年齡、性別、腫瘤部位、組織病理類型、TNM分期、淋巴結轉移等臨床病理因素的相關性無統計學意義，但它可以影響結直腸癌患者接受含奧沙利鉑輔助化療方案治療的PFS，進一步多因素Cox風險模型分析顯示XRCC1 Arg399Gln基因多態性Gln/Arg、Arg/Arg是結直腸癌患者不良預后的獨立危險因素。羅鵬飛等[7]報道，XRCC1 Arg399Gln基因多態性可以影響大腸癌肝轉移患者奧沙利鉑化療后的近期療效、無進展生存期(PFS)。盡管如此，目前XRCC1 Arg399Gln基因多態性影響奧沙利鉑療效的機制尚未完全明確，其可能機制包括如下兩點[8-9]：一方面，Gln→Arg突變可以改變XRCC1蛋白的氨基酸序列，XRCC1蛋白的DNA損傷修復功能受到影響；另一方面，Gln→Arg突變可能可以促使XRCC1基因高表達，從而降低DNA損傷劑的殺細胞效應。

在本研究中，XRCC1 Arg399Gln基因型分布研究顯示結腸癌患者Gln/Gln、Gln/Arg、Arg/Arg構成比分別為66.4%、27.4%、6.2%，與楊農等[10]報道相近，這說明XRCC1 Arg399Gln基因多態性分布的地域差異可能較小。由于Arg/Arg的構成比較低，如果單獨列組在統計學處理時易得出假陰性結論，因此將其與Gln/Arg合并為非Gln/Gln基因型組。進一步臨床資料指標比較顯示，Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組的性別、年齡、病理類型、癌腫部位、腫瘤形態、TNM分期、T分期、CEA比較差異無統計學意義(P>0.05)，這說明結腸癌患者的主要臨床資料指標與XRCC1 Arg399Gln基因多態性的相關性較弱甚至無相關性。但值得注意的是，在遠期療效指標比較方面，Gln/Gln基因型組的復發轉移率顯著低于非Gln/Gln基因型組，3年生存率顯著高于非Gln/Gln基因型組(P<0.05)。由此可見，XRCC1 Arg399Gln基因多態性可以影響結腸癌患者術后FOLFOX4輔助化療的遠期療效，XRCC1 Arg399Gln基因多態性分析可以用于預測該方案治療結腸癌患者的預后。

[1]仇宇，周春花，楊農，等.MTHFR基因多態性與結腸癌患者術后FOLFOX4輔助化療療效的關系〔J〕.腫瘤防治研究，2013，40(6)：595-598.

[2]姜健，梁軍，李青芳，等.晚期胃癌病人血清XRCC1基因多態性與奧沙利鉑化療效果的相關性〔J〕.青島大學醫學院學報，2010，46(1)：19-21，25.

[3]劉同欣.晚期胃癌患者外周血XPD、XPA、XRCC1、GSTP1基因多態性對以奧沙利鉑為基礎的化療方案臨床療效及生存的預測作用〔D〕.南昌大學，2011.

[4]吳云云.結直腸癌患者GSTP1、XRCC1基因多態性與奧沙利鉑術后輔助化療效果的相關性研究〔D〕. 蘇州大學，2014.

[5]陳建新，喬建國.Ⅱ～Ⅲ期老年結腸癌患者行根治手術輔助化療的預后分析〔J〕.實用癌癥雜志，2015，30(6)：853-855.

[6]廖瑜倩，萬以葉，彭麗香，等.XRCC1194Arg/Trp基因多態與晚期乳腺癌患者鉑類方案近期療效的相關研究〔J〕.實用癌癥雜志，2012，27(6)：568-571.

[7]羅鵬飛.大腸癌肝轉移患者XRCC1基因多態性與奧沙利鉑療效相關性研究〔D〕.中南大學，2011.

[8]劉龍靜，李桂生，陳海輝.XRCC1單核苷酸多態性與鼻咽癌鉑類化療敏感度的相關性〔J〕.腫瘤防治研究，2015，42(7)：681-686.

[9]付婷，秦立強，潘旭東，等.XRCC1基因多態性與晚期非小細胞肺癌鉑類化療敏感性關系的Meta分析〔J〕.江蘇醫藥，2015，41(12)：1401-1403.

[10]楊農，仇宇，王靜，等.XRCC1基因多態性與結腸癌術后FOLFOX4化療療效相關性分析〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2013，20(22)：1736-1739.

(編輯：甘艷)

Influence of XRCC1 Gene Polymorphism on Efficacy of Postoperative Chemotherapy with FOLFOX4 for Colon Cancer

LU Hongquan，HUANG Guoding，LIN Ying，et al.

The First People’s Hospital of Danzhou，Danzhou，571700

ObjectiveTo explore the influence of X-ray cross complementing repair gene 1(XRCC1) Arg399Gln gene polymorphism on efficacy of postoperative adjuvant chemotherapy with FOLFOX4 for colon cancer.Methods113 cases of colon cancer were given radical operation.The XRCC1 Arg399Gln gene polymorphism in tumor tissues was detected by pyrophosphoric acid sequencing method after surgery，and all patients received 6 cycles of postoperative adjuvant chemotherapy with FOLFOX4.Patients were followed up after treatment.Results⑴There were 3 kinds of allelotype of XRCC1 Arg399Gln in 113 cases of colon cancer，including Gln/Gln，Gln/Arg and Arg/Arg，and their composition ratios were 66.4%(75/113)，27.4%(31/113) and 6.2%(7/113)，respectively.⑵There had no statistical differences in gender，age，pathological type，tumor location，tumor morphology，TNM stage，T stage and cancer embryo antigen(CEA) between Gln/Gln genotype group and non-Gln/Gln genotype group(P>0.05).⑶During the follow-up，the incidence of recurrence or metastasis in Gln/Gln genotype group were statistically lower than those of non-Gln/Gln genotype group(P<0.05)，while the 3-year survival rate was significantly higher than that of non-Gln/Gln genotype group(P<0.05).ConclusionThe XRCC1 Arg399Gln gene polymorphism may affect the long-term outcome of postoperative adjuvant chemotherapy with FOLFOX4 for patients with colon cancer.

X-ray cross complementing repair gene1(XRCC1)；Gene polymorphism；Colon cancer

571700 海南省儋州市第一人民醫院

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.08.007

R735.3+5

A

1001-5930(2016)08-1239-03

2015-12-18

2016-03-20)