漆樹(shù)籽粕多糖的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

陳虹霞，王成章，2，*，葉建中，周　昊，2，陶　冉，李文君（.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京20042；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京0009）

漆樹(shù)籽粕多糖的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

陳虹霞1，王成章1，2，*，葉建中1，周昊1，2，陶冉1，李文君1
（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210042；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京100091）

以脫脂后的漆樹(shù)籽粕為原料，采用熱回流提取漆樹(shù)籽粕多糖，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化該方法的最佳工藝條件，并進(jìn)一步研究漆樹(shù)籽粕多糖對(duì)羥自由基和ABTS+自由基的清除能力。結(jié)果表明：最佳工藝條件為提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度80℃和提取次數(shù)2次，此時(shí)籽粕多糖的得率為1.561%。漆樹(shù)籽粕多糖對(duì)清除羥自由基和ABTS+自由基的IC50分別為8.515 mg·mL-1和7.03 mg·mL-1，當(dāng)漆樹(shù)籽粕多糖的濃度為25 mg·mL-1時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到61.5%，當(dāng)濃度為10 mg·mL-1時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除率達(dá)到58.4%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明漆樹(shù)籽粕多糖抗氧化活性作用明顯。

漆籽，籽粕，多糖，提取，抗氧化活性

漆樹(shù)（Rhus succedanea L）是漆樹(shù)科漆樹(shù)屬的一種落葉喬木，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，廣泛分布于四川盆地。漆籽為漆樹(shù)的果實(shí)，我國(guó)每年產(chǎn)漆籽量約為200多萬(wàn)噸，漆籽的外果皮中富含漆蠟，因其具較好的黏彈性能，廣泛應(yīng)用于高級(jí)化妝品、潤(rùn)滑劑和綠色表面活性劑等領(lǐng)域［1］。漆蠟是漆籽中的主要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，其加工方式主要為壓榨法和溶劑法，漆樹(shù)籽粕是漆蠟生產(chǎn)完后的主要附產(chǎn)物，其每年的產(chǎn)量約為100萬(wàn)噸，但目前對(duì)其加工利用較弱，大部分都作為燃料焚燒。因此從漆樹(shù)籽粕中發(fā)現(xiàn)具有高活性的天然化合物引起了廣泛關(guān)注。

多糖是一類具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的高分子化合物，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中［2］。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，多糖對(duì)于人類具有很高的價(jià)值，特別是植物多糖因其充足資源和低毒高效的藥理活性廣泛應(yīng)用于食品和藥物領(lǐng)域［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)目前從植物中分離得到數(shù)百種植物多糖，大量的藥理實(shí)驗(yàn)表明，多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抑菌、抗病毒、抗氧化等［5-7］作用。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)漆籽的研究主要集中在漆蠟和漆籽油的提取、脫色以及漆脂改性等方面［8-10］。為了提高漆籽資源的綜合效益，增加漆樹(shù)籽粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，本文利用熱回流浸提方法對(duì)漆樹(shù)籽粕中的多糖進(jìn)行提取并采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究漆樹(shù)籽粕多糖的體外抗氧化活性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

漆樹(shù)籽2014年10采集于湖南桃源，自然晾干、粉碎成粉末，備用；石油醚、乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、ABTS、過(guò)硫酸鉀、甲醇、抗壞血酸、BHT購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水自制。

MULTISKAN GO酶標(biāo)儀Thermo fisher scientific. oy；離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋上海江星儀器有限公司；FD-1冷凍干燥儀北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入蒸餾水溶解并定容到50 mL，得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.9 mL的1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL的試管中，補(bǔ)加蒸餾水至終體積為1.0 mL，分別加入1.0 mL 5%的苯酚，搖勻后，加入3.5 mL的濃硫酸，迅速振蕩搖勻，室溫下靜置25 min，在490 nm處測(cè)吸光度。繪制吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合線性回歸方程。回歸方程Y=0.0081X-0.0139，相關(guān)系數(shù)R=0.9996。葡萄糖在20～180 μg區(qū)間具有良好的線性關(guān)系。

1.2.2熱回流浸提漆樹(shù)籽粕多糖漆籽粉末，加入料液比1∶10（g∶mL）的石油醚在70℃下，提取4次，每次3 h，過(guò)濾，濾液合并，真空濃縮為漆蠟。濾渣干燥，即為漆樹(shù)籽粕。取漆樹(shù)籽粕10 g，放入500 mL燒瓶中，按一定的料液比加入一定的蒸餾水，在一定的溫度下，提取一定時(shí)間后過(guò)濾，得到濾液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃真空濃縮至50 mL，加入無(wú)水乙醇，與多糖水溶液的體積比約為25∶1，在4℃下靜置24 h，離心（8000 r/min）得到沉淀，再用乙醚、丙酮（體積比約為10∶1）洗多糖沉淀兩次，最后將沉淀冷凍干燥得到各多糖提取物。按照1.2.1的方法在490 nm下測(cè)定吸光度。漆樹(shù)籽粕多糖的得率（%）=（多糖的質(zhì)量/原料的質(zhì)量）×100。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇提取溫度90℃，料液比1∶10（g∶mL），提取2次，提取時(shí)間2 h為固定條件，考察提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h），提取溫度（50、60、70、80、90、100℃），料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL）和提取次數(shù)（1、2、3和4次）對(duì)熱回流提取漆樹(shù)籽粕粗多糖得率的影響。

1.2.4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度90℃，料液比1∶20（g∶mL），提取次數(shù)2次，提取時(shí)間2 h為固定條件，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取漆樹(shù)籽粕多糖的三個(gè)主要因素提取時(shí)間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）進(jìn)行優(yōu)化，選用L9（33）正交表，進(jìn)行三因素三水平9組實(shí)驗(yàn)，各因素水平表如表1所示。

表1　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素-水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal experiment methodology

1.2.5漆樹(shù)籽粕多糖對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定將漆樹(shù)籽粕多糖提取物用蒸餾水配制成0.1～50 mg/mL的濃度梯度，以VC和BHT作為對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取1 mL樣品溶液，加入1 mL濃度為9 mmol/L的FeSO4溶液，混合均勻后加入1 mL濃度為8.8 mmol/L的過(guò)氧化氫和1 mL濃度為9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，于37℃水浴中反應(yīng)1 h，于510 nm處測(cè)其吸光度，空白對(duì)照對(duì)蒸餾水代替樣品溶液［11］。對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；A1為樣品的吸光度；A2為50%乙醇溶液代替水楊酸乙醇溶液的吸光度。

1.2.6對(duì)ABTS+自由基清除能力的測(cè)定儲(chǔ)備液的制作：將7.4 mmol/L的ABTS溶液與2.6 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液等量混合，在黑暗處常溫靜置反應(yīng)15 h，然后取1 mL溶液用甲醇稀釋，得到溶液在732 nm處的吸光度為0.74［12］。

將不同濃度的漆樹(shù)籽粕多糖提取物、VC和BHT 150 μL加入2.85 mL的上述儲(chǔ)備液，混合均勻，在黑暗處常溫靜置反應(yīng)2 h，在732 nm處測(cè)吸光度，計(jì)為A1。以蒸餾水作為空白對(duì)照，在黑暗處常溫靜置反應(yīng)2 h，在732 nm處測(cè)吸光度，計(jì)為A2。

式中：A1為待測(cè)樣品、ABTS在樣品溶劑存在體系存在下的吸光度，A2為ABTS在樣品溶劑存在下的吸光度。1.2.7數(shù)據(jù)分析采用Origin 7.5軟件進(jìn)行繪圖及計(jì)算，采用SPSS 19.0方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響從圖1中可以看出，當(dāng)時(shí)間在0.5～2.5 h之間，多糖的得率增長(zhǎng)較快，多糖的得率從0.693%增加至1.409%，提取時(shí)間在2.5 h后，多糖的得率增長(zhǎng)緩慢。提取時(shí)間對(duì)漆樹(shù)籽粕多糖的得率影響較大，說(shuō)明提取時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響水與植物細(xì)胞中多糖化合物的接觸程度，提取時(shí)間長(zhǎng)，多糖化合物萃取得比較完全。

圖1　提取時(shí)間對(duì)熱回流提取漆樹(shù)籽粕多糖得率的影響Fig.1　Effect of extracting time on the yield of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

2.1.2提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響如圖2所示，隨著提取溫度的上升，漆樹(shù)籽粕粗多糖的得率先增大而后緩慢減少，溫度從50～80℃，多糖的得率從0.662%增至1.355%，說(shuō)明溫度的增大有利于多糖化合物的溶出。但是溫度增至90～100℃時(shí)，多糖得率略微有些下降，說(shuō)明在高溫條件下，較多色素類及其他化合物溶出，雜質(zhì)量多，且高溫會(huì)使多糖類化合物發(fā)生降解。

圖2　提取溫度對(duì)熱回流提取漆樹(shù)籽粕多糖得率的影響Fig.2　Effect of extracting temperature on the yield of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

2.1.3料液比對(duì)多糖提取得率的影響如圖3所示，料液比從1∶5（g∶mL）上升至1∶25（g∶mL），漆樹(shù)籽粕多糖得率從0.605%上升至1.465%，料液比的增大對(duì)多糖的溶出具有較大影響，特別是料液比從1∶5（g∶mL）增加到1∶10（g∶mL），多糖提取得率增加速度較快，而后增加緩慢。說(shuō)明當(dāng)水量較大時(shí)，能夠與籽粕組織細(xì)胞中的多糖進(jìn)行充分接觸，從而大大增加了傳質(zhì)效率。

2.1.4提取次數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響如圖4所示，提取1次時(shí)多糖的得率為1.073%，提取2次時(shí)多糖的得率為1.314%，而后增加次數(shù)，多糖的增長(zhǎng)緩慢。縮合考慮多糖得率以及能耗，選擇熱回流提取漆樹(shù)籽粕多糖的提取次數(shù)2次為宜。

2.2正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

圖3　料液比對(duì)熱回流提取漆樹(shù)籽粕多糖得率的影響Fig.3　Effect of extracting ratio of material to water on the yield of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

圖4　提取次數(shù)對(duì)熱回流提取漆樹(shù)籽粕多糖得率的影響Fig.4　Effect of extraction times to water on the yield of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of the orthogonal test

提取時(shí)間、料液比和提取溫度是影響漆樹(shù)籽粕多糖得率的主要因素，以漆樹(shù)籽粕多糖得率為考察指標(biāo)，按照L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

根據(jù)直觀分析，從R值可以看出，各因素對(duì)漆樹(shù)籽粕多糖得率的影響大小為提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間。從表2可以看出，熱回流提取漆樹(shù)籽粕多糖的最佳工藝條件為A2B2C2或A2B3C2，即提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL）或1∶25（g∶mL），提取溫度80℃。方差分析顯示，各因素存在顯著性影響。考慮到實(shí)際應(yīng)用，料液比越高，能耗越高，所以最終的最佳工藝條件選擇提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度80℃和提取次數(shù)2次。

表3　正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3　ANOVA table of orthogonal test

以正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的最佳工藝條件，即提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度80℃和提取次數(shù)2次，進(jìn)行3次熱回流提取多糖的平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，漆樹(shù)籽粕多糖得率為1.561%。

2.3漆樹(shù)籽粕多糖的抗氧化作用

2.3.1漆樹(shù)籽粕多糖對(duì)羥基自由基的清除能力化合物的抗氧化活動(dòng)歸因于各種反應(yīng)和機(jī)制，如自由基清除、還原能力，防止連鎖啟動(dòng)和螯和催化反應(yīng)過(guò)程中的金屬離子等。羥自由基被認(rèn)為是氧化應(yīng)激損傷主要原因，其很容易穿過(guò)細(xì)胞膜，與大多數(shù)生物大分子反應(yīng)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)和DNA［13］。不同濃度的VC、BHT和漆樹(shù)籽粕多糖提取物對(duì)羥基自由基的清除能力如圖5所示。漆樹(shù)籽粕多糖提取物對(duì)羥基自由基具有較強(qiáng)的清除能力，濃度從0.1 mg·mL-1增加至25 mg·mL-1時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率顯著增大（p＜0.01），當(dāng)濃度為25 mg·mL-1時(shí)，清除率為61.5%。其作用效果低于VC和BHT，其IC50為8.515 mg·mL-1。說(shuō)明漆樹(shù)籽粕多糖中的含有羥基官能團(tuán)能提供氫質(zhì)子，從而能夠有效阻止自由基反應(yīng)，將自由基轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的物質(zhì)［14］。

2.3.2漆樹(shù)籽粕多糖對(duì)ABTS+自由基的清除能力ABTS+自由基是抗氧化活性測(cè)定應(yīng)用中最廣泛的人工合成自由基之一。在有供氫能力的活性物存在時(shí)，ABTS+自由基與之反應(yīng)，由藍(lán)綠色變成沒(méi)有顏色的ABTS［15］。利用該方法研究漆樹(shù)籽粕多糖提取物的抗氧化能力。由圖6可知，對(duì)ABTS+自由基的清除率與漆樹(shù)籽粕多糖的濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度從0.1 mg·mL-1增加至10 mg·mL-1時(shí)，清除率隨著濃度的增大顯著增強(qiáng)（p＜0.01）。當(dāng)濃度在10 mg·mL-1時(shí)，清除率為58.4%，清除效果低于VC和BHT，其IC50值為7.03 mg·mL-1。以上數(shù)據(jù)可以說(shuō)明漆樹(shù)籽粕多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖6　漆樹(shù)籽粕多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力Fig.6　ABTS radical acavenging activity of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L

3　結(jié)論

采用熱回流提取漆樹(shù)籽粕多糖，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：提取時(shí)間2.5 h，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度80℃和提取次數(shù)2次，在此條件下籽粕多糖的得率為1.561%。研究漆樹(shù)籽粕多糖對(duì)羥自由基和ABTS+自由基的清除能力，并與VC和BHT進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明漆樹(shù)籽粕多糖具有一定的抗氧化活性，其清除能力低于VC和BHT。當(dāng)濃度為25 mg·mL-1時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為61.5%，IC50為8.515 mg·mL-1。當(dāng)濃度為10 mg·mL-1時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除率為58.4%，IC50值為7.03 mg·mL-1。

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Extraction optimization of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L and its antioxidant activity

CHEN Hong-xia1，WANG Cheng-zhang1，2，*，YE Jian-zhong1，ZHOU Hao1，2，TAO Ran1，LI Wen-jun1
（1.Institute of Chemical Industry of Forestry Products，CAF Key and Open Lab on Forest Chemical Engineering，SFA，Nanjing 210042，China；2.Institute New Technology of Forest，CAF，Beijing 100091，China）

Single factor and orthogonal methodology were used to optimize the extraction conditions of crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L，then the antioxidant（scavenging hydroxyl and ABTS radicals）of the crude polysaccharides from the seed cakes of Rhus succedanea L were possessed.The optimum extraction conditions were as follows：extraction time 2.5 h，ratio of material to water 1∶20（g∶mL），extraction temperature 80℃，and extraction times 2.Under the optimized conditions，an experimental yield was 1.561%.The IC50values scavenging hydroxyl and ABTS+radicals of the crude polysaccharides were 8.515 mg·mL-1and 7.03 mg·mL-1，respectively.The hydroxyl radical scavenging ability of polysaccharides reached 61.5%at 25 mg·mL-1.The ABTS+radicals scavenging ability of polysaccharides reached 58.4%at 10 mg·mL-1.The seed cakes polysaccharides displayed significant antioxidant.

Rhus succedanea L；seed cakes；polysaccharides；extraction；antioxidant activity

TS255.1

B

1002-0306（2016）04-0254-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.043

2015－08－24

陳虹霞（1983-），女，博士研究生，助理研究員，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)方面的研究，E-mail：shirenyahui@126.com。

王成章（1966-），男，博士，研究員，主要從事天然產(chǎn)物研究與利用方面的研究，E-mail：wangczlhs@sina.com。

國(guó)家林業(yè)局948技術(shù)引進(jìn)項(xiàng)目（2015-4-46）；中國(guó)林科院林業(yè)新技術(shù)所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（CAFINT2013C03）；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（2014DFR31300）。