響應面法優化油松花粉蛋白酶解工藝

范三紅，杜靜婷，王相帥（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

響應面法優化油松花粉蛋白酶解工藝

范三紅，杜靜婷，王相帥
（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

以油松花粉蛋白為原料，蛋白水解度為評價指標，對油松花粉蛋白酶解工藝進行研究。首次優選出堿性蛋白酶為最佳水解酶，然后在單因素實驗的基礎上，采用Plackett-Burman設計挑選出對油松花粉水解工藝有顯著影響的三個因素：加酶量、pH和底物濃度。采用Box-Behnken中心組合實驗及響應曲面分析法得到油松花粉蛋白水解的最優工藝條件為：加酶量0.04 g/g樣品，pH11.1，底物濃度0.09 g/mL，酶解時間5 h，酶解溫度50℃，油松花粉蛋白的水解度為79.07%。本文的研究為油松花粉多肽及其功能性食品的開發提供了理論基礎。

油松花粉，蛋白，蛋白酶水解，響應面

油松又名松黃，泛指馬尾松、油松、赤松、黑松和云南松等松屬植物的雄性配子體，是我國傳統食藥兼用的花粉品種［1］。松花粉作為生命的遺傳物質，含有豐富的蛋白質、微量元素、必需脂肪酸等營養成分及黃酮，多糖等生物活性物質［2-3］，而且配比合理，有“微型營養庫”之稱［4］，花粉內部的蛋白質含量為7%～35%，氨基酸占總量的20%左右［5］。現代藥理藥效研究表明油松花粉及其提取物具有抗衰老、抗疲勞、促進生長發育、調整機體代謝、增強非特異性免疫功能、清除羥自由基等功效［6-7］，其保健和治療作用已得到國內外廣泛的認可和應用［8］。

通過對油松花粉蛋白的水解處理，可將蛋白酶解為多肽，有利于更好的開發油松花粉蛋白，有效提高油松花粉蛋白的利用率［9］。研究證明，將大分子的蛋白酶解成多肽以后，更有利于人體的吸收，使得油松花粉蛋白的功能特性得到充分體現，同時不破壞花粉原有營養價值［10］。尹樹花，郭麗梅采用正交法優化了堿性蛋白酶水解油松花粉蛋白質工藝［11］，并對兩種堿性蛋白酶的水解效果進行了對比［12］。李升軍等［13］把制備的油松花粉小肽加入化妝品中，初次研究了油松花粉在化妝品方面的應用。本實驗利用PB因素篩選實驗和響應面設計確定出了油松花粉的最佳酶解工藝條件，不僅準確度高，也為日后研究油松花粉多肽和開發油松花粉蛋白的功能性食品奠定了理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

油松花粉蛋白實驗室自制，純度85.66%；酸性蛋白酶5萬U/g、堿性蛋白酶20萬U/g、木瓜蛋白酶50萬U/g北京奧博星生物技術有限責任公司；磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉分析純，天津化學試劑三廠；茚三酮分析純，上海三愛思試劑有限公司。

HRHS24型電熱恒溫水浴鍋青島海爾醫用低溫科技有限公司；TG16A-WS型高速離心機武漢愛斯佩科學儀器有限公司；101-2AB型電熱鼓風干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司；JP-040ST型超聲波清洗機深圳市潔盟清洗設備有限公司；868型酸度計美國奧利龍公司；JA1203N型電子天平上海精密科學儀器有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1酶解工藝流程選擇一定的底物濃度→水浴→調節pH→加酶→水浴鍋水浴→煮沸滅酶→離心取上清液→測量水解度［14］。

1.2.2水解酶的篩選選取酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及其復合酶分別對油松花粉蛋白進行水解。計算蛋白水解度，并篩選出水解油松花粉蛋白的最佳水解酶。

1.2.3油松花粉蛋白水解度的單因素實驗采用控制變量法，分別研究加酶量、pH、底物濃度、酶解時間、酶解溫度五個因素對油松花粉蛋白水解度的影響［15］。

1.2.3.1加酶量在pH為11，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解時間為3 h，酶解溫度為45℃，加酶量分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/g樣品的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.3.2pH在加酶量為0.03 g/g樣品，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解時間為3 h，酶解溫度為45℃，pH分別為9、10、11、12、13的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.3.3底物濃度在加酶量為0.03 g/g樣品，pH為11，酶解時間為3 h，酶解溫度為45℃，底物濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/mL的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.3.4酶解時間在加酶量為0.03 g/g樣品，pH為11，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解溫度為45℃，酶解時間分別為1、2、3、4、5 h的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.3.5酶解溫度在加酶量為0.03 g/g樣品，pH為11，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解時間為3 h，酶解溫度分別為35、40、45、50、55℃的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.4Plackett-Burman篩選實驗設計在單因素基礎上，對加酶量、pH、底物濃度、酶解時間、酶解溫度五個因素進行顯著性篩選實驗，選擇對油松花粉蛋白水解度有顯著影響的因子，進行后續的響應面實驗。

1.2.5響應曲面實驗設計在單因素實驗和Plackett-Burman篩選實驗的基礎上，對所確定的因子進行Box-Behnken中心組合實驗，確定出油松花粉水解的最優條件。

表1　Plackett-Burman實驗因素和水平Table 1　Range of different factors investigated with Plackett-Burman

表2　Box-Behnken實驗因素和水平Table 2　Factors and levels of Box-Behnken design

1.3水解度的測定和計算方法

采用茚三酮比色法測定水解度［16］，首先將煮沸滅酶的油松花粉蛋白水解液離心取其上清液4 mL，再加蒸餾水4 mL，取稀釋后的油松花粉蛋白水解液2 mL，加pH為8的緩沖溶液1.0 mL，茚三酮溶液1.0 mL，沸水浴加熱10～15 min，冷卻，在570 nm處測其吸光度值（蒸餾水做空白對照）。另取同樣條件的原油松花粉蛋白溶液，在570 nm處測其吸光度值，按照如下公式計算油松花粉蛋白水解度。

式中：A表示在標準曲線中查出的蛋白質的質量（μg）；w表示樣品質量（g）；V1表示水解液的總體積（mL）；V2表示顯色時所稀釋液的體積（mL）。

1.4數據統計分析

使用Minitab 15.0，Design Expert 8.0.6，Excel軟件分析實驗數據，并進行響應面設計。

2　結果與分析

2.1水解酶的篩選

由圖1可以看到不同種類的酶和復合酶以及復合酶的比例對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，油松花粉蛋白水解的結果由圖1所示。單獨選取堿性蛋白酶時，水解度最大。選取酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及這三種酶復合水解時，油松花粉蛋白的水解度均有不同程度的降低。這可能是因為酶的專一性，實驗中蛋白來源是由堿提酸沉法所提取，堿溶性蛋白居多，因而選擇堿性蛋白酶時，油松花粉蛋白水解度最大［17］。

2.2油松花粉水解度的單因素實驗結果

2.2.1加酶量對油松花粉水解度的影響由圖2可以看出加酶量對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢隨著加酶量的提高而逐漸增大，但在加酶量大于0.04 g/g樣品后，水解度的增大趨勢明顯減小。這可能是因為加酶量在0.04 g/g樣品之后，蛋白的水解程度達到最大，酶解反應已經充分，再增加酶也無法促進水解反應。考慮到節約材料，所以選擇最佳加酶量為0.04 g/g樣品。

圖1　不同種類的酶及其復合酶的不同比例對油松花粉蛋白水解度的影響Fig.1　Effect of different proportions of enzymes and different types of compound enzyme on the degree of hydrolysis of pine pollen

圖2　加酶量對水解度的影響Fig.2　Effect of total enzyme dose on hydrolysis degree

2.2.2pH對油松花粉蛋白水解度的影響由圖3可以看到pH對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，隨著pH的提高，水解度呈現先增大后減小的趨勢，當pH 為11時，水解度達到最大。這可能是因為隨著pH增大，逐漸接近堿性蛋白酶的最適pH，當pH繼續增大，堿性太強，有可能酶的內部結構發生了變化，酶活性降低，使得水解度下降。

圖3　pH對水解度的影響Fig.3　Effect of pH on hydrolysis degree

2.2.3底物濃度對油松花粉蛋白水解度的影響由圖4可以看到底物濃度對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，隨著底物濃度的提高，水解度呈現先增大后減小的趨勢，在底物濃度為0.08 g/mL時，水解度達到最大。這可能是因為在底物濃度過低時，油松花粉蛋白與水解酶的接觸不是很充分，而隨著底物濃度增大，水解反應逐漸充分。在底物濃度過大時，溶液濃度較高，阻礙了與酶的接觸，使油松花粉蛋白水解度下降。

圖4　底物濃度對水解度的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on hydrolysis degree

2.2.4酶解時間對油松花粉蛋白水解度的影響由圖5可以看到酶解時間對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，在酶解的初期，隨著酶解時間的增加，油松花粉蛋白水解度也增大，但是在4 h之后，水解度趨于穩定。這可能是因為隨著酶解時間的增加，水解反應不斷的進行使得水解度也不斷增大，在4 h之后，蛋白的酶解反應基本已經充分，水解度不會有明顯的增大。

圖5　酶解時間對水解度的影響Fig.5　Effect of time on hydrolysis degree

2.2.5酶解溫度對油松花粉蛋白水解度的影響由圖6可以看到酶解溫度對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，隨著酶解溫度的上升，水解度先增大后減小，在溫度為50℃時達到最大。這可能是因為隨著酶解溫度的上升，水解酶的活性也在增大，促進了水解反應的進行。溫度高于50℃時，酶的內部結構發生改變，酶活性下降，水解反應得到抑制。

2.3Plackett-Burman實驗顯著影響因子的確定

圖6　酶解溫度對水解度的影響Fig.6　Effect of temperature on hydrolysis

表3　Plackett-Burman Design實驗結果Table 3　Response values of Plackett-Burman Design

2.3.1PB實驗設計處理及響應值在單因素實驗基礎上，對加酶量、pH、底物濃度、酶解時間、酶解溫度這五個因素進行Plackett-Burman實驗，以油松花粉蛋白水解度為響應值，以此篩選出具有顯著性影響的因素。Plackett-Burman Design實驗結果見表3。2.3.2顯著影響因素的確定利用Minitab 15.0軟件油松花粉因素篩選實驗進行分析，得到PB實驗的回歸模型方差分析和回歸方程顯著性檢驗表。

表4　回歸模型方差分析表Table 4　Regression analysis of variance table

由表4可知，主效應的p＜0.001，決定系數R2= 0.9651，說明實驗所得的擬合回歸方程達到顯著水平；校正決定系數R2adj=0.9361，表明本實驗的數據變異可以用此回歸方程來解釋，因此可以較好地確定關鍵影響因素。

由表5回歸方程顯著性檢驗表可知，因素A、B、C 的p值小于0.01，說明這三個因素對實驗具有極顯著的影響。因此，在油松花粉水解度的優化實驗中，對A、B、C即加酶量、pH、底物濃度進行響應面實驗設計。D、E分別選擇酶解時間5 h，酶解溫度50℃作為最優工藝條件。

表5　回歸方程顯著性檢驗表Table 5　Regression equations significant test table

表6　Box-Behnken Design實驗設計與結果Table 6　Box-Behnken Design and response values

2.4響應曲面實驗設計對最佳工藝條件的確定

2.4.1Box-Behnken實驗設計與結果以油松花粉蛋白水解度為響應，利用Minitab 15.0軟件進行響應曲面設計，Box-Behnken Design實驗設計與結果見表6。

對表6中數據進行回歸分析，得到油松花粉蛋白水解度對溫度、加酶量、時間的三元二次回歸方程為：

Y=4.0800A+0.9752B+3.5900C-7.5308A2-9.6358B2-4.2808C2+2.4550AB-0.8900AC+0.0150BC+78.5376

表7　回歸方程方差分析Table 7　Analysis of variances for the fitted regression model

從回歸系數方差分析（表7）可以看出，本實驗所選的三元二次回歸模型具有較好的顯著性（p＜0.01），各因素對油松花粉蛋白的線性關系也呈現極顯著性（p＜0.01），平方項對該模型具有極顯著性（p＜0.01），交互作用不具有顯著性（p＞0.05）。決定系數R2=0.9778，校正決定系數R2adj=0.9380，說明該模型能解釋93.8%響應值的變化，從失擬項在p=0.14＞0.05（不顯著），說明可以利用該回歸方程確定油松花粉蛋白的最佳水解度［17-19］。

表8　回歸系數顯著性分析Table 8　Significance test for each regression coefficient of the fitted regression model

從回歸系數顯著性分析（表8）可以看出，A、C、A2、B2、C2這幾個因素對油松花粉蛋白水解度的影響是極顯著的（p＜0.01），說明在該實驗中，加酶量、底物濃度對油松花粉蛋白水解度有極顯著影響，而從A2、B2、C2影響極顯著也可以看出，它們對油松花粉蛋白水解度的影響是非線性的［20-21］。

2.4.2響應曲面分析與優化根據以上的分析利用Design Expert 8.0.6分別作出該響應面分析的曲面圖形。圖7～圖9可以直觀的分析出加酶量、pH、底物濃度對油松花粉蛋白水解度的影響。

加酶量和pH的交互作用對油松花粉水解度的影響由圖7所示，加酶量在0.04～0.05 g/g樣品之間，pH 在10.5～11.5時，油松花粉蛋白水解度存在最大值。加酶量和底物濃度的交互作用對油松花粉水解度的影響由圖8所示，加酶量在0.04～0.05 g/g樣品之間，底物濃度在0.08～0.10 g/mL時，油松花粉蛋白水解度存在最大值。pH和底物濃度的交互作用對油松花粉水解度的影響由圖9所示，pH在10.8～11.2之間，底物濃度在0.08～0.10 g/mL時，油松花粉蛋白水解度存在最大值。

圖7　加酶量和pH交互影響水解度的響應面圖Fig.7　Response surface for the effects of total enzyme dose and pH on hydrolysis degree

圖8　加酶量和底物濃度交互影響水解度的響應面圖Fig.8　Response surface for the effects of total enzyme dose andsubstrate concentration on hydrolysis degree

圖9　pH和底物濃度交互影響水解度的響應面圖Fig.9　Response surface for the effects of pH and substrateconcentration on hydrolysis degree

利用Minitab 15.0，對油松花粉蛋白水解度工藝條件經行優化預測，得出理論最佳工藝條件為：加酶量為0.043 g/g樣品，pH為11.091，底物濃度為0.089 g/mL，酶解時間5 h，酶解溫度50℃，油松花粉蛋白水解度最大為80.029%。

2.4.3油松花粉蛋白水解工藝條件的驗證與確定為了進一步驗證響應面實驗結論的準確性，同時考慮到實驗操作的可行性及方便性，對預測的最佳實驗條件進行修正：加酶量為0.04 g/g樣品，pH為11.1，底物濃度為0.09 g/mL，酶解時間5 h，酶解溫度50℃。按照此優化條件對油松花粉蛋白進行水解，實驗重復3次并取平均值作為最后實驗結果。據此得到油松花粉蛋白水解度為79.13%、78.99%、79.08%，平均蛋白水解度為79.07%，與預測值80.29%相差不大，說明本模型能較好的預測油松花粉蛋白水解度的實際效果，具有很好的應用價值。

3　結論

油松花粉蛋白的酶解工藝中，篩選出堿性蛋白酶為水解油松花粉蛋白質的最佳選擇，加酶量、pH、底物濃度、酶解時間、酶解溫度5個單因素中，加酶量、pH和底物濃度達到了極顯著水平。對這3個因素進行優化分析，得出最佳水解工藝為加酶量0.04 g/g樣品，pH11.1，底物濃度0.09 g/mL，酶解時間5 h，酶解溫度50℃，在此條件下油松花粉水解度可達到79.07%。通過對油松花粉蛋白酶解工藝的優化能夠對蛋白質提取的關鍵共性技術有理論與實際應用方面的指導意義，為促進油松花粉資源高值化利用和精深加工提供一定的技術支撐。

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Optimization of hydrolysis of Chinese pine pollen protein by response surface methodology

FAN San-hong，DU Jing-ting，WANG Xiang-shuai
（College of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

With protein of Chinese pine pollen as the raw material protein hydrolysis degree as an evaluation index，this paper aimed to study the process conditions of pine pollen proteolysis.The alkaline protease was choosen as the bast hydrolase.On the basis of single factor experiment，the Plackett-Burman screening test was adopted to determine three factors（which signifcantly affect）significantly affecting hydrolysis of Chinese pine pollen as：total enzyme dose，pH and substrate concentration.Then，the hydrolysis process conditions of pine pollen protein was optimized by Box-Behnken center combination experiment and response surface methodology.Results showed that the optimum conditions for hydrolysis were as follows：enzyme concentration 0.04 g/g，pH11.1，substrate concentration 0.09 g/mL，enzymatic time 5 h，enzymatic temperature 50℃.Under the optimal conditions，the hydrolysis degree of Chinese pine pollen protein could reach 79.07%.This study provided a theoretical basis for the development of Chinese pine pollen peptides and functional foods.

pine pollen；protein；protease hydrolysis；response surface

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0236-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.039

2015－06－10

范三紅（1963-），男，副教授，研究方向：食品科學，E-mail：fsh729@sxu.edu.cn。

山西省自然科學基金項目（2012011031-4）；山西省高等學校高新技術產業化項目（20111003）。