超聲波預(yù)處理棉籽殼酶法制備低聚木糖的工藝研究

支佳佳，李應(yīng)彪，蔣彩虹，李飛亞，葉家鑫（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

超聲波預(yù)處理棉籽殼酶法制備低聚木糖的工藝研究

支佳佳，李應(yīng)彪*，蔣彩虹，李飛亞，葉家鑫（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

本文以棉籽殼為原料制備低聚木糖。以超聲溫度、超聲時間，料液比和NaOH濃度為單因素，采用正交實驗設(shè)計確定了超聲波預(yù)處理提取木聚糖的最優(yōu)條件，即超聲溫度60℃，超聲時間30 min，料液比為1∶15，NaOH濃度為8%，此時木聚糖得率為33.66%。在單因素料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度的實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析法，以低聚木糖含量為響應(yīng)值建立數(shù)學(xué)模型，確定了最佳酶解工藝條件：料液比1∶20，加酶量4%，酶解時間3.5 h，酶解溫度64℃，此時低聚木糖含量為3.35 mg/mL。

棉籽殼，超聲，木聚糖，酶解，低聚木糖

我國是世界棉花生產(chǎn)大國，棉籽殼資源豐富。但目前我國棉籽殼的利用途徑比較單一，生物利用率極低［1］。尋找棉籽殼新的利用途徑及提高棉籽殼加工附加值是需要解決的問題。棉子殼中半纖維素含量約為34.55%、纖維素為24.85%、木質(zhì)素為31.68%［2］，其中半纖維素的主要成分是木聚糖，木聚糖降解可生成低聚木糖。低聚木糖系是由2～7個木糖分子以α-1，4糖苷鍵結(jié)合而成，以木二糖、木三糖為主要成分的混合物［3］。低聚木糖是一種功能性低聚糖，是目前發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)腸內(nèi)雙歧桿菌的增殖有效用量最小的低聚糖。其理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸、耐熱，并有很強(qiáng)增殖腸道益生菌、改善腸道微生態(tài)環(huán)境等功能［4-5］。

目前，制備木聚糖最常用的方法是堿浸提，堿提具有操作簡便、對設(shè)備要求低、易投入生產(chǎn)等特點(diǎn)，但化學(xué)試劑的引入也對后序的分離提純增加了困難。半纖維素的還原末端帶有各種糖基和支鏈，在堿性條件下發(fā)生水解，得到木聚糖或可溶性木聚糖片段［6］。超聲波提取法是一種優(yōu)良新型的提取技術(shù)，具有提取效率高，提取時間短，不損壞提取物結(jié)構(gòu)，提取工藝運(yùn)行成本低，操作簡單易行等優(yōu)點(diǎn)［7］。其原理是利用超聲振動能量產(chǎn)生的強(qiáng)大剪切力和高溫，使木質(zhì)纖維素生物質(zhì)因振動而破碎，擴(kuò)大孔隙、增加可及度、保水性和比表面積，從而釋放可降解的多糖［8］。水酶法是生產(chǎn)低聚木糖的主要方法，它是利用內(nèi)切型木聚糖酶定向酶解木聚糖，副產(chǎn)物較少，有利于后續(xù)工藝中低聚木糖的分離和純化［9］。堿法提取木聚糖操作簡便，但是提取率不高。超聲輔助提取的引入，可以提高提取率。酶法生產(chǎn)中由于原料和酶制劑的不同導(dǎo)致工藝參數(shù)不同，本文結(jié)合超聲波預(yù)處理，通過響應(yīng)面分析法對酶法水解木聚糖制備低聚木糖進(jìn)行工藝優(yōu)化，探討一套適合從棉籽殼中提取低聚木糖的方法，為棉籽殼資源的有效利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

棉籽殼市售，粉碎細(xì)度80目；木聚糖酶Ruibio公司，酶活力≥60000 U/mg；D-木糖標(biāo)準(zhǔn)品，天津市光復(fù)化工研究所；氫氧化鈉、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司。

多功能粉碎機(jī)諸暨市海道機(jī)械有限公司；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；Neofuge 15R型冷凍離心機(jī)力康發(fā)展有限公司；722可見分光光度計上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2實驗方法

棉籽殼→粉碎（粉碎粒度80目）→超聲輔助浸提（超聲功率100 W）→離心過濾→醇沉（無水乙醇）→烘干得木聚糖（80℃烘干2 h）→酶解→低聚木糖。

1.2.1超聲預(yù)處理各因素的確定

1.2.1.1超聲溫度對木聚糖得率的影響選擇溫度為55、60、65、70、75℃，將棉籽殼按料液比1∶15（g/mL），加入8%NaOH溶液，超聲處理30 min，研究超聲溫度對木聚糖得率的影響。

1.2.1.2超聲時間對木聚糖得率的影響選擇時間為20、25、30、35、40 min，將棉籽殼按料液比1∶15（g/mL），加入8%NaOH溶液，超聲溫度60℃進(jìn)行超聲預(yù)處理，研究超聲時間對木聚糖得率的影響。

1.2.1.3料液比對木聚糖得率的影響選擇料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），將棉籽殼加入8% NaOH溶液后，按超聲溫度60℃，預(yù)處理30 min，研究料液比對木聚糖得率的影響。

1.2.1.4NaOH濃度對木聚糖得率的影響選擇溶劑NaOH溶液濃度為2%、4%、6%、8%、10%，將棉籽殼按超聲溫度60℃，料液比1∶15（g/mL），預(yù)處理30 min，研究NaOH濃度對木聚糖得率的影響。

1.2.2正交實驗設(shè)計優(yōu)化木聚糖提取工藝根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，選擇合適的因素水平設(shè)計實驗（見表1），以正交實驗確定木聚糖的最優(yōu)提取條件。

表1　正交實驗的因素水平Table 1　Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3酶解參數(shù)的選擇按照1.2.2實驗所得最佳超聲預(yù)處理條件預(yù)處理后，料液在6000 r/min離心10 min取上清液，加入3～4倍體積的乙醇靜置8 h，真空抽濾取濾渣，用蒸餾水洗至濾渣無乙醇味，烘干得粗木聚糖。稱取一定量的木聚糖于250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水后用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2.3.1料液比對低聚木糖含量的影響設(shè)定酶解時間4 h，酶解溫度60℃，加酶量4%，研究不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對低聚木糖含量的影響。

1.2.3.2酶添加量對低聚木糖含量的影響設(shè)定料液比1∶20，酶解時間4 h，酶解溫度60℃，在不同的加酶量（1%、2%、3%、4%、5%）條件下對酶解液中低聚木糖含量的影響。

1.2.3.3酶解時間對低聚木糖含量的影響設(shè)定料液比1∶20，加酶量4%，酶解溫度60℃，研究不同酶解時間（1、2、4、6、8 h）對低聚木糖含量的影響。

1.2.3.4酶解溫度對低聚木糖含量的影響設(shè)定料液比1∶20，酶添加量4%，酶解時間4 h，研究不同酶解溫度（45、50、55、60、65℃）對酶解液中低聚木糖含量的影響。

1.2.4響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化工藝根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，選擇合適的因素水平，采用響應(yīng)面分析，以Box-Benhnken中心組合設(shè)計實驗（表2），確定最佳的酶解工藝。

1.2.5測定方法

1.2.5.1木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取25 mg分析純的木糖（預(yù)先在105℃干燥至恒重），定容于250 mL容量瓶。分別吸取該溶液0、5、l0、15、20、25 mL均定容于50 mL，分別取1 mL木糖溶液置于25 mL試管中，再加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸，在沸水浴中沸煮5 min，立即冷卻，用去離子水定容至25 mL，以沒加木糖溶液的液體作空白，用比色皿于550 nm處測吸光度值，以木糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出標(biāo)準(zhǔn)方程Y=0.2425X+0.0014。

1.2.5.2還原糖的測定還原糖測定用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［10］：取1 mL樣品加水量稀釋0.5～3.5 g/L 于25 mL比色管中，再加入去離子水1 mL和DNS試劑1 mL，沸水浴5 min，立即冷卻后定容至25 mL，于550 nm下測定吸光度值（A550）。利用1.2.5.1中標(biāo)準(zhǔn)方程即可求出其還原糖，以還原糖含量代表酶解后的低聚木糖含量。

1.2.5.3總糖測定取提取液1 mL，加入1 mL 72%硫酸溶液，沸水中保溫1 h，使提取液中木聚糖充分水解為木糖，冷卻至室溫用40%氫氧化鈉溶液中和至中性，定容至25 mL，從中再取1 mL按照1.2.5.1步驟測定吸光度值，并對照木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總糖含量。

木聚糖提取得率（%）=［（提取液中總糖量-提取液中還原糖量）×0.88］/絕干原料中的木聚糖×100

其中，0.88—為木聚糖聚合因數(shù)；絕干原料中的木聚糖=棉籽殼量×34.55%。

1.3數(shù)據(jù)處理

用SPSS Statistics17軟件分析正交實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)。用Design-Expert 8.0對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲預(yù)處理各因素的確定

2.1.1超聲溫度對木聚糖得率的影響由圖1可知，隨著溫度的升高，處理后的棉籽殼木聚糖得率也逐漸提高，當(dāng)溫度升至60℃時得率達(dá)到最大。這可能是因為溫度升高加快了分子運(yùn)動，提高反應(yīng)速度，但溫度過高可能會破壞糖鏈結(jié)構(gòu)，不利于提取。因此，超聲預(yù)處理溫度選擇60℃。

圖1　超聲溫度對木聚糖得率的影響Fig.1　Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of xylane

2.1.2超聲時間對木聚糖得率的影響由圖2可知，隨著提取時間的延長木聚糖得率逐漸增大，當(dāng)超聲時間為30 min時，木聚糖得率達(dá)到最大值；超聲時間大于30 min時，木聚糖得率隨著時間的增大而降低。這可能是因為時間過長，導(dǎo)致其有效成分分解。因此，最佳超聲時間選擇30 min。

圖2　超聲時間對木聚糖得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic time on extraction rate of xylane

2.1.3料液比對木聚糖得率的影響由圖3可知，當(dāng)料液比小于1∶15時，木聚糖得率隨著料液比的升高而逐漸升高；當(dāng)料液比大于1∶15時，木聚糖得率升高不顯著。這可能是因為料液比升高，溶液黏度降低，不利于木聚糖的溶出。因此，選擇料液比1∶15為最佳預(yù)處理條件。

圖3　料液比對木聚糖得率的影響Fig.3　Effect of the ratio of solid to liquid on extraction rate of xylane

2.1.4NaOH濃度對木聚糖得率的影響由圖4可知，隨著NaOH濃度的升高，木聚糖得率逐漸增大，但當(dāng)NaOH濃度從8%到10%時，木聚糖得率雖有所增加卻沒有6%到8%增加明顯，可能是因為原料中的木聚糖已經(jīng)完全溶出，而且高濃度的NaOH消耗量更大，考慮到經(jīng)濟(jì)原因，因此，選擇NaOH濃度8%作為最佳預(yù)處理條件。

圖4　NaOH溶液濃度對木聚糖得率的影響Fig.4　Effect of NaOH concentration on extraction rate of xylane

2.2正交分析及工藝優(yōu)化

2.2.1正交實驗設(shè)計及結(jié)果由表3中木聚糖得率的R值可知，影響得率的因素排序為C＞A＞D＞B。綜合各因素K值和直觀比較，得出理論上最佳得率工藝條件為A2B2C2D3。由正交實驗結(jié)果分析最佳提取工藝，在超聲溫度60℃，超聲時間30 min，料液比為1∶15，NaOH濃度為8%的條件下做驗證實驗，得出木聚糖得率為33.66%。

2.3預(yù)處理后酶解條件的研究

2.3.1料液比對低聚木糖含量的影響由圖5可知，隨著料液比的增加，酶解液中低聚木糖的含量逐漸增加，當(dāng)料液比大于1∶20時，低聚木糖含量增加不明顯。這可能是因為酶反應(yīng)速度與底物濃度呈線性關(guān)系，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到酶促反應(yīng)最大速度的一半時，反應(yīng)速度增幅緩慢［11］。所以從生產(chǎn)角度來考慮，選擇底物的料液比為1∶20。

表3　正交實驗結(jié)果Table 3　The results of orthogonal experiment

圖5　料液比對低聚木糖含量的影響Fig.5　Effect of the ratio of solid to liquid on oligosaccharide content

2.3.2酶添加量對低聚木糖含量的影響由圖6可知，隨著加酶量的增加，酶解液中低聚木糖的含量逐漸增加，當(dāng)加酶量小于4%時，低聚木糖含量增加幅度較大，當(dāng)加酶量大于4%時，低聚木糖含量增加幅度變小并趨于平緩。在酶濃度較低時，酶結(jié)合的底物少，隨著酶量的增加，酶結(jié)合的底物越來越多，但是由于底物量有限，進(jìn)一步增加酶添加量也不能提高低聚木糖的量［12］。因此選擇酶添加量為4%。

圖6　加酶量對低聚木糖含量的影響Fig.6　Effect of volume of enzyme on oligosaccharide content

2.3.3酶解時間對低聚木糖含量的影響由圖7可知，隨著酶解時間的延長，酶解液中低聚木糖的含量先增大后緩慢下降。這可能是因為隨著酶解產(chǎn)物的積累，生成的產(chǎn)物占領(lǐng)了酶分子上的特殊位點(diǎn)，使酶不能結(jié)合底物，產(chǎn)生競爭性抑制。為了使低聚木糖含量最高，選擇4 h為最適酶解時間。

圖7　酶解時間對低聚木糖含量的影響Fig.7　Effect of zymolytic time on oligosaccharide content

2.3.4酶解溫度對低聚木糖含量的影響由圖8可知，隨著酶解溫度的升高，酶解液中的低聚木糖含量先增加后減少，在60℃達(dá)到最高值。這可能是因為溫度低時酶活性較低，但當(dāng)溫度過高會導(dǎo)致酶的變性，降低酶活性。因此，選擇酶解最適溫度為60℃。

圖8　酶解溫度對低聚木糖含量的影響Fig.8　Effect of zymolytic temperature on oligosaccharide content

2.4響應(yīng)面分析及工藝優(yōu)化

2.4.1響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果由Design-Expert 8.06統(tǒng)計分析軟件的實驗設(shè)計功能可知，4因素3水平的中心組合設(shè)計包括29個實驗方案，具體的實驗方案及實驗結(jié)果如表4所示。

利用Design-Expert 8.06統(tǒng)計軟件，通過回歸分析對表4實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到料液比（A′）、加酶量（B′）、酶解時間（C′）和酶解溫度（D′）4個因素對低聚木糖含量（Y）的二次回歸方程為：

Y=3.69+0.097A′+0.16C′+0.15D′+0.17A′D′-0.13B′C′-0.26C′D′-0.36A′2-0.29B′2-0.14C′2-0.17D′2。

對該回歸模型及其系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果見表5。由表5的方差分析可知：模型的p＜0.0001，說明該模型是極顯著的，一次項C′、D′均極顯著，說明酶解時間、酶解溫度對低聚木糖含量影響極顯著。交互項C′D′的偏回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平，A′D′、B′C′的偏回歸系數(shù)達(dá)到顯著水平，表明各影響因素對低聚木糖含量的影響不是簡單的線性關(guān)系。失擬項p值為0.515＞0.05，不顯著。模型決定校正系數(shù)R2Adj= 0.8471，說明模型能解釋84.71%的響應(yīng)值變化；模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為R2=0.9017，說明擬合度良好，該模型可以用于實驗工藝條件的預(yù)測。

表4　響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 4　Experimental design and results for MSA

2.4.2最佳條件的響應(yīng)面優(yōu)化擬合的響應(yīng)面比較直觀的反映了各因素間的交互作用，其交互因素影響顯著的響應(yīng)面圖如圖9～圖11所示。

如圖9所示，當(dāng)料液比和酶解溫度處于較低水平時，隨著料液比和酶解溫度的增大，低聚木糖含量逐漸上升后緩慢降低；當(dāng)料液比處于較高水平時，隨著酶解溫度的升高低聚木糖含量明顯上升后趨于平穩(wěn)，當(dāng)酶解溫度處于較高水平時，隨著料液比的增加，低聚木糖含量先緩慢上升后緩慢下降。結(jié)果表明，料液比和酶解溫度之間的交互影響顯著。

如圖10所示，當(dāng)加酶量處于較低水平時，隨著酶解時間的增大，低聚木糖含量明顯上升后趨于平穩(wěn)，當(dāng)加酶量處于較高水平時，隨著酶解時間的增大，低聚木糖含量變化幅度不大；在酶解過程中隨著加酶量的增大，低聚木糖含量逐漸升高后緩慢降低。結(jié)果表明，酶添加量與酶解時間之間的交互影響顯著。

表5　回歸模型及方差分析結(jié)果Table 5　Regression model and analysis of variance

圖9　料液比和酶解溫度對低聚木糖含量交互影響的響應(yīng)面圖Fig.9　Response surface of effects of the ratio of solid to liquid and zymolytic temperature

圖10　酶解時間和加酶量的交互影響的響應(yīng)面Fig.10　Response surface of effects of zymolytic time and volume of enzyme

如圖11所示，當(dāng)酶解時間和酶解溫度處于較低水平時，隨著酶解時間和酶解溫度的升高，低聚木糖含量逐漸升高；當(dāng)酶解時間和酶解溫度處于較高水平時，對低聚木糖含量的影響不大。結(jié)果表明，酶解時間和酶解溫度的交互性影響極顯著。

圖11　酶解溫度和酶解時間的交互作用的響應(yīng)面Fig.11　Response surface of effects of zymolytic temperature and time

Box-Behnken模型響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果為：料液比1∶21.46，加酶量4.2%，酶解時間3.56 h，酶解溫度63.98℃，此時低聚木糖含量為3.75 mg/mL。各因素對低聚木糖含量的影響大小依次為：酶解時間、酶解溫度、料液比、加酶量。考慮實際操作條件，調(diào)整為料液比1∶20，加酶量4%，酶解時間3.5 h，酶解溫度64℃。采用修正后的條件參數(shù)，進(jìn)行3次平行驗證實驗，結(jié)果測得低聚木糖含量為3.35 mg/mL，與預(yù)測值3.75 mg/mL相比的RSD為0.3%，兩者較接近。

3　結(jié)論

超聲預(yù)處理的最佳條件為：超聲溫度60℃，超聲時間30 min，料液比1∶15，NaOH濃度8%。在此條件下預(yù)處理得到的棉籽殼中木聚糖得率為33.66%。利用Design-Expert 8.06統(tǒng)計軟件，選用Box-Behnken模型對酶解實驗條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合實際情況得到最優(yōu)酶解工藝條件為料液比1∶20，加酶量4%，酶解時間3.5 h，酶解溫度64℃，此時低聚木糖含量為3.35 mg/mL，與理論預(yù)測值3.75 mg/mL接近，說明模型可靠性較高，能很好的預(yù)測實驗結(jié)果。

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Study on xylan extraction from cottonseed husk enhanced
by ultrasonication and enzymatic hydrolysis of xylan to xylooligosaccharides

ZHI Jia-jia，LI Ying-biao*，JIANG Cai-hong，LI Fei-ya，YE Jia-xin （Food College of Shihezi University，Shihezi 832000，China）

The preparation of xylooligosaccharide from cottonseed husk was studied in this paper.Orthogonal experimental design was used to select optimal conditions of ultrasonic extraction of xylan.When the ultrasonic temperature was 60℃，the ultrasonic time was 30 min，the ratio of material to liquid was 1∶15，the concentration of NaOH was 8%，the extraction rate of xylan was 33.66%.Based on the experimental results of single factor：ratio of material to liquid，the amount of enzyme，the time of enzyme hydrolysis and the temperature of the enzyme hydrolysis，using four factors and three levels of response surface methodology to analyse the influence of each single factor and interaction.The reducing sugar content in response to the value of establishing mathematical model，the optimum conditions were as follows：the ratio of solid to liquid was 1∶20，the accession of the xylanase was 4%，zymohydrolysis time was 3.5 h，zymohydrolysis temperature was 64℃.Under this condition，3.35 mg/mL oligosaccharide content was produced.

cottonseed husk；ultrasonic wave；xylan；enzymatic hydrolysis；xylooligosaccharides

TS201.3

A

1002-0306（2016）04-0217-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.035

2015－08－17

支佳佳（1989-），女，在讀碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工方面的研究，E-mail：zjj3366@163.com。

李應(yīng)彪（1964-），男，教授，研究方向：農(nóng)畜產(chǎn)品加工，E-mail：lybfood@sohu.com。

“：十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題（2011BAD23B03）。