新型中國被毛孢胞內多糖HSIPS2鏈構象及抗氧化活性研究

邵雙雙，賀　亮，韋朝陽，李衛旗，*（.浙江大學生命科學學院，浙江杭州30058；.浙江省林業科學研究院生物技術所，浙江杭州3003）

新型中國被毛孢胞內多糖HSIPS2鏈構象及抗氧化活性研究

邵雙雙1，賀亮2，韋朝陽1，李衛旗1，*
（1.浙江大學生命科學學院，浙江杭州310058；2.浙江省林業科學研究院生物技術所，浙江杭州310023）

以發酵得到的中國被毛孢菌絲體為原料進行熱水浸提，經過醇沉、脫蛋白、脫色素以及DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱色譜和Sephacryl S-100凝膠柱色譜得到均一性多糖組分（HSIPS2），并對該組分進行鏈構象及抗氧化活性分析。結果表明：HSIPS2的單糖組成及摩爾比例為葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶核糖=48.52∶6.58∶5.17∶1.0，其絕對分子量為1.46×104g/mol，純度為99.82%；該多糖在0.1 mol/L的NaNO3溶液中呈柔順鏈構象，流體力學半徑Rh=2.3 nm，ML=334.05 nm-1，q=0.70 nm，d=0.69 nm；同時，HSIPS2清除羥自由基的IC50為0.749 mg/mL，氧自由基吸收能力（ORAC值）為872.80 μmol TE/g，說明HSIPS2具有較高的抗氧化能力。

中國被毛孢，多糖，鏈構象，氧自由基吸收能力

天然蟲草自然資源短缺，價格昂貴，人工培養的蟲草易于得到，其有效成分及藥理活性與天然蟲草非常接近。中國被毛孢（Hirsutella sinensis）是從天然蟲草中分離得到的蟲草菌之一，被確認為冬蟲夏草真正的無性型［1-3］。

越來越多的研究表明，多糖是除了蛋白質和核酸之外另一種重要的生命物質，具有多方面、復雜的生物活性及功能［4］。蟲草多糖是冬蟲夏草的主要活性成分之一，具有很好的藥理活性，如抗氧化、調節血糖、免疫調節、抗腫瘤等多方面均有報道［5］，在醫藥、食品和保健品研發上具有誘人的應用前景。結構決定其生物活性，不同的高級構象表現出不同的生物功能，因此，開展多糖等大分子高級構象的研究具有非常重要的意義。

近年來，有關中國被毛孢多糖的提取分離以及初級結構的研究比較多［6-7］，但是對其胞內多糖分子鏈構象的研究目前還沒有涉及。本實驗首次對發酵得到的中國被毛孢胞內多糖進行分子鏈構象分析，并對其抗氧化活性進行研究，為其多糖類物質的開發利用奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

中國被毛孢菌株（HS001） 由浙江省林業科學研究院提供；葡萄糖（Glc）、巖藻糖（Fuc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rham）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖醛酸（GalUA）、阿拉伯糖（Ara）以及核糖（Rib） Sigma公司；無水乙醇、氯仿等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

CL31R型多功能高速離心機美國Thermo公司；R-210型旋轉蒸發儀瑞士BUCHI公司；冷凍干燥機美國LABCONCO公司；U-1900型可見分光光度計日本HITACHI公司；Spectra Max M2多功能酶標儀美國分子儀器公司；AKTA purifier層析系統美國GE醫療集團；戴安U-3000型高效液相色譜儀美國Dionex公司；DAWN-II多角度激光光散射儀美國Wyatt Technology Co；RID-10A示差折光儀日本SHIMADZU公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株及其發酵培養［8］孢菌株（HS001）在斜面培養基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、麥麩10 g、蠶蛹粉10 g、瓊脂20 g、去離子水1000 mL，自然pH）中4℃保存，然后接種到平板培養基（配方同斜面培養基），18℃條件下培養40 d后，接種到發酵培養基（葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、蠶蛹粉10 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、去離子水1000 mL）26℃振蕩培養30 d。

1.2.2多糖的提取及分離純化參考王蕾等的方法［9］，并做了適當修改。將發酵液經8層紗布過濾，得到的菌絲體再用蒸餾水沖洗3次，凍干。將干燥后的菌絲體粉碎后過60目篩，按料液比為1∶20加去離子水，90℃浸提2 h，8000 r/min離心15 min，收集上清液，濾渣重復提取1次，合并2次提取液。50℃下減壓濃縮，凍干得粗多糖。粗多糖溶于水，Sevage法脫蛋白后，采用雙氧水法進行脫色素，濃縮，透析（3500 u）。將脫完蛋白色素的多糖樣品，過DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱（2.0 cm×35 cm），用蒸餾水、0.1、0.3、0.5和0.7 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，洗脫用量依次為28、28、28、28、48 mL流速為1.0 mL/min，每管收集4 mL，采用苯酚-硫酸法檢測分布，分別從每管吸取0.2 mL收集液，加入0.8 mL去離子水，1.0 mL 5%的苯酚，再加5 mL濃硫酸，充分振蕩，室溫反應1 h，490 nm測吸光值。分別收集不同洗脫峰的洗脫液，合并同一洗脫峰的洗脫液，經濃縮、透析、凍干，即可得到幾個不同的多糖組分。用Sephacryl S-100凝膠柱色譜（1.6 cm×60 cm）對主峰多糖組分進一步純化，蒸餾水做洗脫液，流速為0.5 mL/min，每管收集3 mL，分別從每管吸取0.2 mL收集液，加入0.8 mL去離子水，1.0 mL 5%的苯酚，再加5 mL濃硫酸，充分振蕩，室溫反應1 h，490 nm測吸光值，檢測糖分布。可得到純化后的中國被毛孢胞內多糖HSIPS2。

1.2.3單糖組成單糖成分測定參考Dai等［10］的方法，并做了適當的修改。10種單糖（5 mol/L），分別取150 μL，加入150 μL 0.6 mol/L NaOH溶液，混合均勻后，加入300 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇液，混勻，70℃水浴100 min，冷卻至室溫后，加入300 μL 0.3 mol/L HCl中和，然后加入等體積氯仿，充分振蕩、離心（4000 r/min，15min），收集水相，重復5次，過0.45 μm膜，待HPLC測定。

取純化后的多糖3 mg，加入1 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液，121℃水解6 h后，加入200 μL甲醇，60℃減壓濃縮蒸干，去除殘留的三氟乙酸，反復3次，最后加入150 μL去離子水溶解，衍生化方法與上述單糖衍生化制備一致。

RP-HPLC測定條件：檢測波長為245 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫：25℃，柱子：HYPERSIL APS-2 （4.6 mm×250 mm，5 μm，Agilent，USA），進樣體積為20 μL，流動相A（乙腈）：流動相B（0.05 mol/L PBS緩沖液，pH6.9）為15∶85。

1.2.4多糖分子量及鏈構象研究采用靜態光散射和動態光散射系統（SEC-MALLS）與在線差動式粘度計（ViscoStarTM II，Wyatt Technology，USA）聯用進行測定，可以精確獲得多糖的分子量（Mw）、均方根旋轉半徑（＜S2＞z1/2）、流體力學半徑（Rh）和特性粘度（［η］）等構象參數［11］，進而構建模型獲知多糖鏈構象。

配制0.1 mol/L NaNO3溶液（含有0.02%NaN3）作為流動相，過0.22 μm膜，超聲脫氣30 min。稱取3 mg樣品溶解于1 mL 0.1 mol/L NaNO3溶液中，磁力攪拌溶解4 h，過0.22 μm膜備用。

參考Rau等［12］的方法，折光率增量dn/dc為0.135 mL/g。進樣量為200～300 μL，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫。采用ASTRA version軟件（Wyatt Technology）進行數據收集和計算。

1.2.5抗氧化活性

1.2.5.1羥自由基清除率參考Mao等［13］的測定方法并稍作修改，具體方法為：2.0 mL FeSO4溶液（6 mmol/L）分別與2.0 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品混勻，加入2 mL H2O2（6 mmol/L），搖勻，室溫靜置10 min后，加入2.0 mL水楊酸（6 mmol/L），混勻，室溫靜置10 min，于510 nm處測定吸光值，VC作為陽性對照，對羥自由基的清除能力按照下面公式進行計算：

其中，A0為空白樣品吸光值，As加樣后的吸光值，Aj為以蒸餾水代替H2O2的吸光值。

1.2.5.2氧自由基吸收能力（ORAC）使用熒光素作為氧化底物，偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）為自由基產生劑，并使用Trolox抗氧化劑作為定量樣品抗氧化能力的標準。ORAC測定參考Hua等［14］的方法并稍作了修改，在96孔板的微孔中加入20 μL熒光素（35 nmol/L）、40 μL待測樣品液和140 μL AAPH （12.8 mmol/L）。該反應在75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）體系中進行，檢測溫度為37℃，激發波長為485 nm，發射波長為528 nm，每隔2 min測定一次吸光強度，持續98 min。ORAC實驗需要設定兩種對照，即沒有添加自由基的熒光素的自然衰減對照（-AAPH）和沒有抗氧化劑存在時的自由基作用對照（+AAPH）。各個微孔不同時間點的絕對熒光強度與其初始時間的熒光強度之比，得到相對熒光強度，以相對熒光強度采用近似積分法計算熒光衰退曲線下面積（AUC）。Net AUC=AUCsample－AUCblank，AUCblank為沒有添加自由基的熒光素的自然衰減，Net AUC與抗氧化物的濃度呈正相關。ORAC值=［AUCsample－AUCblank］（Trolox摩爾濃度/樣品摩爾濃度），即Trolox當量（TE），以μmol TE/g表示。

1.3數據分析

采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0軟件對相關數據進行統計分析。

2　結果與分析

2.1多糖的提取及分離純化

由圖1可知，多糖脫蛋白脫色素后，經過DEAESepharose Fast Flow色譜柱分離，由0.1 mol/L NaCl溶液洗脫得到組分HSIPS1（17.07%），由0.3 mol/L NaCl溶液洗脫得到組分HSIPS2（82.93%），組分HSIPS1的得率與HSIPS2相比較低，所以收集主要組分HSIPS2 過Sephacryl S-100凝膠柱進一步純化，得到單一對稱的洗脫峰，見圖2。

圖1　中國被毛孢胞內多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow洗脫曲線Fig.1　Elution profile of polysaccharide from Hirsutella Sinensis on DEAE-Sepharose Fast Flow column

圖2　HSIPS2的Sephacryl S-100柱層析洗脫曲線Fig.2　Chromatography of HSIPS2 by gel filtration on Sephacryl S-100

2.2HSIPS2的單糖組成

根據10種單糖標準品的液相色譜圖（圖3）和HSIPS2單糖組成的HPLC色譜圖（圖4）可知，HSIPS2的單糖組成及摩爾比例為：葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶核糖=48.52∶6.58∶5.17∶1.0，說明HSIPS2主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成，這與劉金花等［15］從中國被毛孢發酵蟲草菌絲體得到的HSP-1單糖組成類似（葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖=4.522∶1∶1.378），但是檢測到HSIPS2中含有核糖（1.63%），目前其他文獻還沒有報道，說明發酵后得到的HSIPS2是一種新型的多糖。

圖3　10種單糖標準品的HPLC色譜圖Fig.3　High-performance liquid chromatography of 10 standard monosaccharides

圖4　HSIPS2的HPLC色譜圖Fig.4　High-performance liquid chromatography of HSIPS2

2.3HSIPS2的分子量及鏈構象

如圖5所示，樣品峰出現在12～18 min之間，90°光散射和示差檢測器RI所產生的峰形具有相似大小和形狀，幾乎完全重疊。并且顯示多糖呈現單一對稱峰，HSIPS2為均一性的純多糖，而LS信號主峰前的小峰可能是由多糖部分團聚而引起，測得第二維利系數A2=1.0×10-4mol·mL/g2，A2＞0，說明溶劑為良性溶劑［16］。同時，測得HSIPS2多糖純度達到99.82%。此外，Mw/Mn表示樣品的分散度，分子量分布越寬，分散度就越大［17］。儀器檢測給出Mw/Mn的值為1.017，比較接近1，表明HSIPS2是一個低分散度的多糖，其分子量Mw= 1.463×104g/mol。均方旋轉半徑＜S2＞z1/2測得為0.5 nm，由于儀器無法測定＜10 nm的粒子半徑，所以給出的＜S2＞z1/2值不準確，需要以該分子的流體力學半徑Rh= 2.3 nm來表征。

圖5　HSIPS2的SEC-MALLS尺寸排阻色譜圖Fig.5　SEC chromatogram of HSIPS2 detected by SEC-MALLS

Mark-Houwink方程（［η］=KMwα）可以表示高分子在溶液中的特性粘度［η］與分子量Mw之間的關系［18］。由圖6可知，以lg［η］對lgMw作圖得到一條線性關系較好的直線，R2為0.9512，依據直線的斜率和截距求得K=9.67×10-3，α=0.67，從而建立HSIPS2多糖的Mark-Houwink方程［η］=9.67×10-3Mw0.67，根據參數α可推斷出HSIPS2多糖在0.1 mol/L NaNO3溶液中的構象為柔順鏈［19］。流體力學半徑Rh與分子量Mw的關系Rh=KMwv可用于進一步推斷多糖在溶液中的鏈形態［20］。由圖7可知，以lgRh對lgMw作圖得到一條線性直線，R2為0.9919，依據直線的斜率和截距求得K=1.16×10-2，ν值為0.56，根據參數ν同樣推斷出HSIPS2多糖在0.1 mol/L NaNO3溶液中的構象為柔順鏈［19］。

圖6　lg［η］對lgMw的對數圖Fig.6　Logarithmic plot of Mwvs［η］

圖7　lgRh對lgMw的對數圖Fig.7　Logarithmic plot of Mwvs Rh

Yamakawa-Fujii-Yoshizaki（YFY）蠕蟲鏈模型可用于計算分子鏈的剛性參數，參考Yang等［21］的方法，YFY模型關系可近似表達為：

B0為近似為常數，取值為1.05，A0可按下列公式計算：

Φ∞，0為Flory常數，dr≤0.1時，Φ∞，0=2.86×1023，ν為偏微分比容0.68 cm3/g。

由圖8可知，以（Mw2/［η］）1/3對Mw1/2作一條關系曲線，得到Bohdanecky圖。根據Bohdanecky圖中的線性關系方程以及上述式（1）～式（6）公式可以計算得到剛性參數：ML=334.05 nm-1，q=0.70 nm，d=0.69 nm。ML值越大鏈的剛性越強，剛性鏈通常在500～2000 nm-1之間，因此，HSIPS2在0.1 mol/L NaNO3溶液中的構象為柔順鏈，q=0.70 nm表明HSIPS2為無規則線團高分子鏈（0.5～1.0 nm），d=0.69 nm表明HSIPS2分子鏈為單鏈（＜1 nm）［22］。

圖8　HSIPS2的Bohdanecky圖Fig.8　The Bohdanecky plot of HSIPS2

2.4抗氧化活性

圖9　VC和HSIPS2對羥自由基的清除率Fig.9　Hydroxyl radical scavenging activity of VCand HSIPS2

2.4.1羥自由基清除率如圖9所示，在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內，隨著濃度的增大，VC和HSIPS2對羥自由基的清除能力越強；當濃度為1.0 mg/mL時，VC和HSIPS2對羥自由基清除力大小分別為99.01%和74.68%，VC和HSIPS2清除羥自由基的IC50分別為0.291 mg/mL和0.749 mg/mL，HSIPS2對羥自由基的清除能力要比VC弱，但是與Liu等［23］從中國被毛孢發酵菌絲體中分離純化得到的多糖HSP-1相比較，HSIPS2對羥自由基的清除能力要稍高于HSP-1（IC50為0.834 mg/mL）。

2.4.2氧自由基吸收能力（ORAC）圖10為標準品Trolox在不同濃度下的相對熒光強度衰退曲線，圖11 為HSIPS2在15 μg/mL時的相對熒光強度衰退曲線。Trolox系列標準液標準曲線線性方程為：y=1.0581x+ 4.0779，R2=0.9991。根據標準曲線線性方程計算得到，HSIPS2的ORAC值為872.80μmolTE/g，高于Wojcikowski等［24］測得蟲草ORAC值（117.28 μmol TE/g）。

圖10　不同濃度Trolox標準品熒光衰退曲線Fig.10　Fluorescence decay curve affected by different concentration of Trolox

圖11　HSIPS2多糖的熒光衰退曲線Fig.11　Fluorescence decay curve effected by HSIPS2

3　結論

發酵得到的中國被毛孢菌絲體經過提取分離及純化后，得到新型多糖組分HSIPS2。HPLC測得HSIPS2單糖組成及摩爾比例為葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖∶核糖=48.52∶6.58∶5.17∶1.0；采用靜態光散射和動態光散射系統（SEC-MALLS）與在線差動式粘度計（ViscoStarTM II，Wyatt Technology，USA）聯用，進行檢測分析得知：HSIPS2分子量為1.463×104g/mol，純度為99.82%，是一個低分散度，分子量較為均一的多糖；HSIPS2在0.1 mol/L的NaNO3溶液中呈柔順鏈構象，構象參數：Rh=2.3 nm，ML=334.05 nm-1，q=0.70 nm，d=0.69 nm；同時，HSIPS2清除羥自由基的IC50為0.749 mg/mL，ORAC值為872.80 μmol TE/g，說明HSIPS2具有較高的體外抗氧化能力，多糖HSIPS2的高效活性可能受到其較低分子量、單糖組成和鏈構象的影響，但其機理尚未清楚。總之，HSIPS2可以開發為一種新的抗氧化添加劑應用到食品、化妝品和藥品等行業。

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Chain conformation and antioxidant activity of a novel intracellular polysaccharide HSIPS2 from Hirsutella sinensis

SHAO Shuang-shuang1，HE Liang2，WEI Chao-yang1，LI Wei-qi1，*
（1.College of Life Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；2.Institute of Biological Technology，Zhejiang Forestry Academy，Hangzhou 310023，China）

A novel intracellular polysaccharide，named HSIPS2，from Hirsutella sinensis was obtained by hot water extraction and alcohol precipitation，and then purified using DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography and Sephacryl S-100 gel column chromatography.Its chain conformation and antioxidant activity were determined. The result showed that HSIPS2 was composed of glucose，galactose，mannose，and ribose with a molar ratio of 48.52∶6.58∶5.17∶1.0.It was proved to be a novel lower dispersion polysaccharide with uniform molecular of 1.463×104g/mol，and the purity was 99.82%.In 0.1 mol/L NaNO3aqueous solution，HSIPS2 existed as flexible chain conformation.The parameters of Rh，ML，q and d were 2.3 nm，334.05 nm-1，0.70 nm，and 0.69 nm respectively. Moreover，the IC50of its hydroxyl radical scavenging activity was identified to be 0.749 mg/mL and the value of ORAC was calculated to be 872.80 μmol TE/g.Hence，it was undoubtedly demonstrated that HSIPS2 exhibited potent antioxidant activity.

Hirsutella sinensis；polysaccharide；chain conformation；ORAC

TS201.2

A

1002-0306（2016）04-0200-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.032

2015－08－24

邵雙雙（1990-），女，碩士研究生，研究方向：微生物學，E-mail：shaoshuanger@sina.com。

李衛旗（1964-），男，博士，副教授，研究方向：天然產物加工，E-mail：liweiqi2014@sina.com。

浙江省科技攻關項目（2012C12004-4）；浙江省科技計劃項目（2014C32085）。