白藜蘆醇對小鼠脾淋巴細胞免疫調節活性的影響

劉英博，付 越，郝 璐，李敬雙，于 洋（遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001）

白藜蘆醇對小鼠脾淋巴細胞免疫調節活性的影響

劉英博，付 越，郝 璐，李敬雙，于 洋*
（遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001）

研究了白藜蘆醇（Res）對小鼠脾淋巴細胞免疫調節活性的影響。無菌分離小鼠脾，制備淋巴細胞，并用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養，在培養液中分別加入刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）以及5、10、20、40 μg/mL不同濃度的Res，經過不同時間培養后，采用MTT法檢測淋巴細胞的增殖，ELISA法檢測淋巴細胞分泌IL-4和IL-12的水平，流式細胞儀檢測淋巴細胞的細胞周期和細胞膜表面標志。結果表明：Res能夠促進小鼠脾淋巴細胞增殖，能與ConA協同促進小鼠脾淋巴細胞增殖，不能與LPS協同促進小鼠脾淋巴細胞增殖；能增強IL-4和IL-12的分泌；能提高小鼠脾淋巴細胞CD4+/CD8+的比值；能提高脾淋巴細胞周期中細胞進入S期細胞的百分率。綜上，Res能增強小鼠脾淋巴細胞的免疫調節活性。

白藜蘆醇，淋巴細胞，增殖，細胞因子，細胞周期，細胞膜表面標志

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種非黃酮類多酚化合物，化學名為芪三酚（3，4，5-三羥基二苯乙烯trihydroxystilbene），廣泛存在于花生、紅葡萄和漿果類等植物果實中，是植物為抵抗外來侵害時產生的一種植物抗毒素（phytoalexin）［1］。1940年首次發現該成分以來，人們開始對Res生物活性及作用機制進行廣泛深入的研究。迄今為止的研究表明，Res具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗自由基、心血管保護、免疫調節、植物雌激素等多種生物學功能［2-3］。其中抗腫瘤作用研究最為廣泛，近年來，Res的免疫調節作用逐漸受到重視，特別是近年來Res調節細胞信號通路發揮免疫調節作用已成為研究熱點。俞瑜等［4］研究表明Res對IL-2的分泌具有抑制作用，并呈劑量依賴性，同時Res也能抑制T細胞表面活化分子。安利峰

等［5］研究表明，Res能增加免疫抑制小鼠NK細胞殺傷力、T淋巴細胞轉化、抗體釋放量、CH50活性，提高IL-2分泌，減少IL-8分泌。張敏等［6］研究表明，Res作用后，IFN-γ、1L-10及T-bet mRNA、GATA-3 mRNA的表達均明顯降低，具有濃度和時間依賴性。邢永華等［7］對137Cs 4Gy輻射損傷小鼠研究表明，Res能提高白細胞、骨髓有核細胞的數量，降低胸腺指數與脾臟指數，說明Res對輻射損傷小鼠的免疫功能的穩定有積極作用。上述對免疫指標的研究都比較單一，本課題組通過對Res對脾淋巴細胞增殖、細胞亞群、細胞周期和分泌細胞因子的影響進行系統研究，探討Res對小鼠脾淋巴細胞的免疫調節活性，闡明其免疫學效應，為進一步說明Res的藥理作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BALB/C小鼠 雄性，體重18～22 g，購自遼寧醫學院實驗動物中心，飼養于環境溫度（20±2）℃，濕度50%±10%，按照12 h光照/12 h黑暗，自由攝食、飲水的飼養條件喂養，實驗前適應性飼養1周；白藜蘆醇成都曼斯特生物科技有限公司（生產批號：MUST-12032106）；RPMI-1640培養基粉末 美國GIBCO公司；脂多糖（LPS）、刀豆蛋白A（ConA）、MTT 美國Sigma公司；胎牛血清 四季青生物工程有限公司；小鼠IL-4和IL-12細胞因子檢測試劑盒 武漢博士德公司；Anti-CD4、anti-CD8單克隆抗體 美國eBioscience；Hepes、青霉素、鏈霉素 上海生物技術服務公司；二甲基亞砜（DMSO）、細胞周期檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。

FACS Calibur流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；Varioskan FlashT多功能酶標儀 Thermo Fisher Scientific；3110 SeriesⅡ細胞培養箱 Thermo Electron Corporation；3K15冷凍離心機 Sigma Corporation；Milli-Q50超純水凈化系統 Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備小鼠脾淋巴細胞 頸椎脫臼法處死小鼠，用75%酒精浸泡消毒3 min。于超凈臺內分離脾，將脾放于含有PBS的培養皿中，用PBS沖洗2次，將沖洗后的脾放入RPMI-1640培養液中，用5 mL注射器吸取RPMI-1640培養液，將培養液輕輕打入脾內將細胞吹出，重復上述操作數次，直至脾外膜透明，余下脾臟用注射器活塞頭磨碎后過100目篩。收集所有的細胞懸液以1500 r/min的速度離心5 min后將上清棄掉，加Tris-NH4Cl約3 mL，輕輕吹勻后靜置5 min，去除紅細胞，再同樣離心去上清，重復上述步驟，直至紅細胞完全裂解。細胞沉淀用RPMI-1640培養液重懸，以清除細胞中含有的Tris-NH4Cl，并輕輕吹勻，同樣離心棄上清。細胞沉淀用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液懸浮，Trypan Blue染色，細胞計數，活細胞數大于95%，將細胞密度調整為為5×106個/mL，最后制成脾細胞懸液。

1.2.2 MTT法檢測脾淋巴細胞增殖 細胞按每孔5×106個加入96孔細胞培養板中，分別設對照組、Res組、Res+ConA組（5 μg/mL ConA）和Res+LPS組（1μg/mL LPS），每孔再分別加入含不同濃度Res的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，使Res終濃度分別5、10、20、40 μg/mL。37℃，5%CO2培養44 h后每孔加入50 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h。之后每孔加入200 μL DMSO，用微量振蕩器混勻，檢測570 nm的OD值。結果以刺激指數（SI）反映小鼠脾淋巴細胞增殖率的高低：SI=藥物刺激孔OD值/陰性對照孔OD值。

1.2.3 ELISA法檢測細胞因子 細胞按1×106每孔加入96孔細胞培養板中，每孔再分別加入含不同濃度Res的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，使Res終濃度分別為5、10、20、40 μg/mL，培養48 h后，根據小鼠IL-4和IL-12細胞因子檢測試劑盒說明書檢測IL-4 和IL-12細胞因子的含量。

1.2.4 流式細胞儀檢測脾淋巴細胞膜表面標志 細胞按每孔1×106個加入24孔細胞培養板中，每孔再分別加入含不同濃度Res的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，使Res終濃度分別5、10、20、40 μg/mL，培養48 h后，棄培養基，用PBS洗兩次，與anti-CD4、anti-CD8抗體4℃避光反應60 min，用PBS洗兩次后，500 μL PBS重懸，用流式細胞儀檢測細胞膜表面標志CD4和CD8表達量的變化。設定488 nm氬激光強度進行測定，利用數據分析軟件（ModFit LT）分析檢測結果，每個樣品計數104個細胞，結果以CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD4+CD8+的百分率和CD4+/CD8+比值表示Res對小鼠脾淋巴細胞亞群的影響。

1.2.5 流式細胞儀檢測脾淋巴細胞周期 取按上述方法處理過的脾淋巴細胞，根據細胞周期檢測試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀檢測細胞周期，設定488 nm氬激光強度進行測定，利用數據分析軟件（ModFit LT）分析檢測結果，每個樣品計數104個細胞，結果用細胞進入G0/G1期、S期及G2/M期的細胞百分率表示，用S期脾淋巴細胞所占的百分率表示Res對小鼠脾淋巴細胞周期的影響。

1.2.6 統計學分析 各組數據以平均數±標準差表示。應用SPSS 16.0統計軟件進行單因素方差分析和t檢驗。用數據分析軟件（ModFit LT）分析流式細胞儀結果。Res各濃度組與對照組比較：*表示差異顯著（p＜0.05），**表示差異極顯著（p＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇對脾淋巴細胞增殖的影響

2.1.1 白藜蘆醇單獨刺激對脾淋巴細胞增殖的影響

Res單獨刺激脾淋巴細胞，各劑量組均能促進脾淋巴細胞的增殖，結果見圖1。Res各劑量組與對照組比較脾淋巴細胞刺激指數均極顯著提高（p＜0.01），各劑量組之間比較差異均極顯著（p＜0.01）。Res對脾淋巴細胞的增殖能力呈現明顯的劑量依賴關系，Res在低劑量時隨著劑量的升高，刺激指數隨之升高，當劑量達到一定濃度，刺激指數隨濃度升高而降低，表明Res對脾淋巴細胞增殖呈現出雙重調節作用。

圖1 白藜蘆醇對脾細胞增殖的影響Fig.1 The influence of resveratrol on splenocyte proliferation

2.1.2 白藜蘆醇與脂多糖同時刺激對脾淋巴細胞增殖的影響 Res與LPS同時刺激脾淋巴細胞，各劑量組均能促進脾淋巴細胞的增殖，結果見圖1。Res各劑量組與對照組比較脾淋巴細胞刺激指數均極顯著提高（p＜0.01），各劑量組之間比較差異均極顯著（p＜0.01）。Res與LPS同時刺激對脾淋巴細胞的增殖能力有明顯的劑量依賴關系，呈現出雙重調節的作用。但Res與LPS同時刺激比Res單獨刺激各劑量組刺激指數均降低，表明Res不能協同LPS刺激脾淋巴細胞的增殖。

2.1.3 白藜蘆醇與刀豆蛋白A同時刺激對脾淋巴細胞增殖的影響 Res與ConA同時刺激脾淋巴細胞，各劑量組均能促進脾淋巴細胞的增殖，結果見圖1。各劑量組與對照組比較刺激指數均極顯著提高（p＜0.01）；除了10 μg/mL和20 μg/mL兩組之間差異不顯著（p＞0.05）外，其他各組之間差異均極顯著（p＜0.01）。Res與ConA同時刺激比Res單獨刺激各劑量組刺激指數均提高，表明Res能夠協同ConA刺激脾淋巴細胞的增殖。

2.2 白藜蘆醇對脾淋巴細胞分泌細胞因子的影響

2.2.1 白藜蘆醇對脾淋巴細胞分泌IL-4的影響 Res能刺激脾淋巴細胞分泌IL-4，結果見圖2。Res各劑量與對照組比較IL-4分泌均極顯著提高（p＜0.01），各劑量組之間比較差異均極顯著（p＜0.01）。呈現明顯的劑量依賴關系，IL-4的分泌在Res低劑量時，隨著Res劑量的升高而升高，當Res劑量達到一定量時，隨著Res劑量升高而降低，表明Res對小鼠脾淋巴細胞IL-4分泌呈現雙重調節作用。

2.2.2 白藜蘆醇對脾淋巴細胞分泌IL-12的影響 Res能刺激脾淋巴細胞分泌IL-12，結果見圖2。Res各劑量與對照組比較IL-12分泌均極顯著提高（p＜0.01），各劑量組之間比較差異均極顯著（p＜0.01）。呈現明顯的劑量依賴關系，IL-12的分泌隨著Res劑量的升高而升高，呈現正向調節作用。

圖2 白藜蘆醇對脾淋巴細胞分泌細胞因子的影響Fig.2 He influence of resveratrol on splenic lymphocyte secretion of cytokines

2.3 白藜蘆醇對脾淋巴細胞膜表面標志的影響

Res各劑量組均能提高小鼠脾淋巴細胞中CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+表型的T淋巴細胞亞群百分率，結果見表1和圖3。

Res對CD4+CD8-的影響：Res能提高CD4+CD8-百分率，各劑量組與對照組比較均能極顯著（p＜0.01）提高CD4+CD8-百分率。隨劑量的升高而升高，呈正向調節作用。

Res對CD4+CD8+的影響：Res能提高CD4+CD8+百分率，Res濃度為40 μg/mL劑量組與對照組比較能極顯著（p＜0.01）提高CD4+CD8+百分率，Res濃度為5、10、20 μg/mL各劑量組與對照組比較能提高CD4+CD8+百分率，差異不顯著（p＞0.05）。隨劑量的升高而升高，呈正向調節作用。

Res對CD4-CD8+的影響：Res能提高CD4-CD8+百分率，Res濃度為20 μg/mL劑量組與對照組比較能極顯著（p＜0.01）提高CD4-CD8+百分率，Res濃度為10 μg/mL劑量組與對照組比較能顯著（p＜0.05）提高CD4-CD8+百分率，Res濃度為5、40 μg/mL劑量組與對照組比較對提高CD4-CD8+百分率差異不顯著（p＞0.05）。呈現明顯的劑量依賴關系，呈現出雙重調節作用。

Res對CD4+/CD8+的比值的影響：CD4+/CD8+的比值可反映機體的免疫狀況，結果顯示Res各劑量組均能極顯著（p＜0.01）提高CD4+/CD8+比值，隨劑量的升高而升高，呈正向調節作用。表明Res可以正向調節機體免疫。

2.4 白藜蘆醇對脾淋巴細胞周期的影響

Res能促進脾淋巴細胞周期由G0/G1期向S期過度，結果見圖4和圖5。Res各劑量組與對照組比較均能極顯著（p＜0.01）提高脾淋巴細胞進入S期的百分率，表明Res能夠促進脾淋巴細胞由G0/G1期向S期轉化。細胞周期呈現明顯的劑量依賴關系，呈雙重調節作用。

表1 白藜蘆醇對脾淋巴細胞CD4+/CD8+表達的影響Table1 The influence of resveratrol on CD4+/CD8+expression of splenic lymphocyte

圖3 白藜蘆醇對脾淋巴細胞CD4+/CD8+表達的影響Fig.3 The influence of resveratrol on CD4+/CD8+expression of splenic lymphocyte

圖4 白藜蘆醇對脾淋巴細胞進入S期的百分率的影響Fig.4 The influence of resveratrol on the percentage of splenic lymphocyte entering S phase

3 討論

圖5 白藜蘆醇對脾淋巴細胞周期的影響Fig.5 The influence of resveratrol on splenic lymphocyte cycle

3.1 淋巴細胞是機體的免疫活性細胞，是獲得性免疫系統的重要組成部分。而脾臟是機體最大的免疫器官，含有大量的淋巴細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的樞紐。機體免疫功能情況可由淋巴細胞的增殖能力間接反映，如淋巴細胞的活化以及分化為免疫活性細胞，進而增強機體的免疫應答能力［8］。B細胞

主要負責調節機體的體液免疫，T細胞主要負責調節機體的細胞免疫。T細胞還可以進一步分為CD4+T細胞（輔助T淋巴細胞）和CD8+T細胞（毒性T淋巴細胞）。CD4+T和CD8+T細胞之間能夠相互影響，兩者功能的動態平衡對維持機體免疫狀況穩定十分重要。CD4+/CD8+細胞的比值被認為是衡量機體免疫水平的關鍵指標之一［9］。它們能夠釋放促炎細胞因子，負責招募不同的效應細胞，包括巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等。識別抗原后，激活的Th細胞根據功能和分泌細胞因子的差異分為Th1、Th2細胞［10］。Th1和Th2細胞可以分泌不同類型的細胞因子，這也決定了它們的功能差異［11］。IL-4是由Th1細胞分泌的，主要介導體液免疫反應，對B細胞的活化、增殖、分化等不同階段起重要作用。IL-12是由樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞及其他抗原遞呈細胞產生，能促進Th1的增殖，誘導NK細胞和T細胞產生γ干擾素，提高NK細胞的細胞毒作用，促進T細胞的形成，是一種多功能免疫調節因子［12］。細胞周期由G0/G1期向S期過度，使細胞由靜止的G0/G1期向DNA合成期即S期轉化，并為細胞由S期向活躍的有絲分裂期G2/M期轉變提供了必要的條件，從而增強脾淋巴細胞的增殖。本實驗結果表明，Res可通過促進脾淋巴細胞增殖、細胞因子分泌、提高脾淋巴細胞CD4+/CD8+的比值、提高脾淋巴細胞周期中細胞進入S期細胞的百分率來增強機體的細胞免疫和體液免疫功能。但對其免疫調節作用機制尚不清楚，還有待進一步深入研究。

3.2 在研究多糖對T細胞增殖能力的影響時，一般使用多糖與ConA共同刺激，因為ConA是小鼠T細胞特異性有絲分裂刺激物，可促進細胞代謝，增加蛋白質合成，加速細胞分裂。體液免疫是指由B細胞被激活后釋放特異性抗體從而消除細胞外病原體的免疫反應。LPS能夠刺激B細胞的增殖、分化及分泌免疫球蛋白。刺激劑ConA和LPS可使細胞增殖轉化，其機制主要是通過與淋巴細胞膜上的受體結合，進而誘導胞內信號傳導［13］。本研究表明Res能夠協同ConA刺激脾淋巴細胞的增殖，Res不能協同LPS刺激脾淋巴細胞的增殖，與多糖作用效果不同，作用機制有待于進一步研究。

4 結論

Res在一定濃度范圍內能夠促進小鼠脾淋巴細胞增殖，增強細胞因子IL-4和IL-12的分泌，提高小鼠脾淋巴細胞CD4+/CD8+的比值，提高脾淋巴細胞周期中細胞進入S期細胞的百分率。結果表明Res具有一定的免疫調節效應，為其作為免疫佐劑和免疫增強劑提供理論依據，為Res的產業化發展提供技術支持。

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The influence of resveratrol on immunoregulatory activity of mouse splenic lymphocyte

LIU Ying-bo，FU Yue，HAO Lu，LI Jing-shuang，YU Yang*
（College of Animal Husbandry&Veterinary Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

In order to analyze the influence of resveratrol（Res）on immunoregulatory activity of mouse splenic lymphocyte.Aseptic isolation of mouse spleen to prepare lymphocytes which were cultured in RPMI 1640 supplemented with10% fetal calf serum.The culture media was added ConcanavalinA（ConA），lipopolysaccharide（LPS）as well as Res with different concentration，including 5，10，20，40 μg/mL.After being cultured for different time，MTT method was adopted to detect the proliferation of lymphocytes.ELISA method was used to detect the level of lymphocytes secrete IL-4 and IL-12.The flow cytometry was used to detect the cell cycle and cytomembrane surface markers of lymphocytes.Res could promote the proliferation of mouse splenic lymphocyte.The mixture of Res and ConA could promote the proliferation of mouse splenic lymphocyte together，but the mixture of Res and LPS could not promote the proliferation of mouse splenic lymphocyte together.Res could increase the secretion of IL-4 and IL-12 and enhance the ratio of CD4+/CD8+of mouse splenic lymphocyte as well as improve the percentage that the cells in cycle of splenic lymphocyte enter of the cells in S phase.Res could enhance the immunoregulatory activity of mouse splenic lymphocyte.

resveratrol；lymphocyte；proliferation；cytokines；cell cycle；cytomembrane surface markers

TS255.1

A

1002-0306（2016）08-0335-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.062

2015－09－15

劉英博（1992-），男，在讀碩士研究生，研究方向：獸醫藥理學與免疫學，食品營養與安全，E-mail：478194158@qq.com。

*通訊作者：于洋（1962-），男，博士，教授，研究方向：獸醫藥理學與免疫學，E-mail：spyuyang@163.com。

遼寧省科技攻關計劃（2014214016）。