物理處理玉米皮渣對酶法提取阿魏酰低聚糖的影響

解春艷，游雪嬌，侯曉強，吳智艷，*，曹 戈，段秀霞（.廊坊師范學院生命科學院，河北廊坊065000；2.河北省高校食藥用真菌應用技術研發中心，河北廊坊065000；.廣東省微生物研究所，廣東廣州50000）

物理處理玉米皮渣對酶法提取阿魏酰低聚糖的影響

解春艷1，2，游雪嬌3，侯曉強1，2，吳智艷1，2，*，曹 戈1，段秀霞1
（1.廊坊師范學院生命科學院，河北廊坊065000；2.河北省高校食藥用真菌應用技術研發中心，河北廊坊065000；3.廣東省微生物研究所，廣東廣州510000）

以玉米皮渣為原料，考察物理處理對其水解獲得阿魏酰低聚糖產量的影響。通過測定不同方法處理前后玉米皮渣細胞壁組成和其結構變化及阿魏酰低聚糖（Feruloyl oligosaccharides，FOs）產量關系，探討物理處理影響FOs生成的原因。結果表明：高壓蒸煮處理使酶解玉米皮渣生成FOs產量提高了1.5倍，原因是高壓蒸煮改變了玉米皮渣細胞壁的組成，其中纖維素和果膠質得以釋放，增加了纖維素酶和木聚糖酶與底物的接觸幾率；微波和膨化處理均使玉米皮結構裂解，FOs產量無顯著變化。

玉米皮渣，阿魏酰低聚糖，物理處理，酶解

阿魏酰低聚糖（Feruloyl oligosaccharides，FOs）是阿魏酸（Ferulic acid，FA）與糖的羥基通過酯鍵連接成的一類重要的功能性低聚糖［1］，具有增強免疫力的功效，對包括癌癥在內各種疾病的預防具有很好的功效［1］，具有較強的抗氧化活性［2］，對腸道雙歧桿菌增殖作用顯著［3］，可改善腸道菌群、預防腸癌。目前，國內外阿魏酰低聚糖的研究僅限于實驗室水平，尚未有該低聚糖的工業化生產，故其發展空間巨大。

報道稱FOs廣泛存在于禾本科植物細胞壁［4］。玉米是禾本科植物的一種，是我國種植面積最大的糧食作物之一。玉米淀粉加工業產生大量玉米皮渣工業副產物，尚未得到有效利用［5］。玉米皮渣中含有膳食纖維（52.6%～86.0%）、蛋白質（5.0%～13.0%）、淀粉（4.0%～20.0%）和酚類化合物（2.0%～5.5%）等［5］。玉米

皮渣總酚類化合物中，阿魏酸及其聚合物占90%以上［6］。FOs是FA的羧基與糖羥基通過酯鍵連接而成的一類低聚糖，采用化學法、酶法和微生物轉化法均可獲得，目前，常用酶法制備［7］。然而，在玉米種皮細胞壁結構中，半纖維素與纖維素以及半纖維素與木質素的連接，是制約外源酶酶解禾本科植物組織的主要原因［8-9］。本研究擬通過物理方法對玉米皮渣進行處理，以期改變玉米皮渣緊密連接的細胞壁結構，進而促進外源酶的酶解，提高FOs生成量。研究結果將有助于促進FOs的工業化進程，提高玉米皮渣的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米皮渣 購自河北省滄州市淀粉加工廠；木聚糖酶、纖維素酶 由寧夏夏盛實業集團有限公司提供，酶活分別為600萬ug/min·g和140萬ug/min·g；NaOH、濃HCl、無水乙醇、磷酸等 為國產分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈 為國產色譜級，國藥集團化學試劑有限公司。

ALPHA 1-2 LD冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；Hitachi S-3000N掃描式電子顯微鏡、Hei-VAP Advantage旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；安捷倫1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Milli-Q純水機 美國Merck Millipore公司；MLS-3750全自動立式滅菌鍋 日本Sanyo公司；SHZ-82A恒溫振蕩器 常州朗越儀器制造有限公司；P70D20TP-C6微波爐 廣東格蘭仕集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同物理方法處理玉米皮渣 以玉米皮渣為原料，分別對其進行高壓蒸煮、膨化和微波處理。

1.2.1.1 高壓蒸煮處理 取200 g玉米皮渣，添加100 mL蒸餾水，置于500 mL三角瓶中，于高壓滅菌鍋中，采用121℃下處理20 min，溫度降至70℃時，取出，于60℃烘箱中烘干待用。

1.2.1.2 膨化處理 取200 g玉米皮渣，置于小型爆米花機，加熱并進行瞬間膨化處理，膨化時壓力為10 MPa。

1.2.1.3 微波處理 取200 g玉米皮渣置于家用微波爐中進行微波處理，采用中高火，微波功率為525 W，微波處理時間為5 min。

1.2.2 酶解玉米皮渣制備FOs 按上述方法對玉米皮渣分別進行高壓蒸煮、膨化和微波處理，然后烘干、粉碎后過80目篩，同時取已過80目篩的未處理樣品，分別置于50 mL三角瓶中，按料液比1∶10比例添加磷酸緩沖溶液（50 mmol/L，pH為5.0），并添加纖維素酶（10 g/L）和木聚糖酶（10 g/L），于60℃酶解1 h，95℃滅酶10 min，4000 r/min離心15 min，分別測定上清液中FOs含量［10］。

1.2.3 玉米皮渣電鏡掃描 對不同方式處理過的玉米皮渣進行電子顯微鏡掃描（scanning electron microscope，SEM），加速電壓15.0 kV，放大倍數1500×，通過電鏡掃描圖觀察物理處理前后玉米皮渣原料縱橫切面形態的變化。

1.2.4 玉米皮渣細胞壁的提取 分別取5 g經高壓蒸煮、膨化和微波處理及未處理的玉米皮渣，經研缽研磨后轉入離心管中，加50 mL磷酸緩沖液（0.5 mol/L，pH為7.0），振蕩混勻后于4000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用50 mL上述緩沖液洗兩遍，再用蒸餾水洗1次后，沉淀用50 mL氯仿甲醇溶液（體積比1∶1）［11］，于室溫下浸提30 min，4000 r/min離心10 min，再用氯仿甲醇溶液沖洗2次，沉淀用50 mL苯酚/乙酸/水溶液室溫振蕩（100 r/min）浸提30 min，4000 r/min離心10 min，再用苯酚/乙酸/水溶液沖洗2次（離心去上清），再加蒸餾水50 mL，按照玉米皮渣0.2%的添加量添加α-淀粉酶，離心后，再用蒸餾水淋洗細胞殘留物，重復操作兩次后，獲得的沉淀物于60℃烘干備用。

1.2.5 FOs的測定

1.2.5.1 FOs含量 阿魏酰低聚糖是阿魏酸與低聚糖以酯鍵形式連接，經堿解后可釋放阿魏酸，現報道的FOs結構中阿魏酸與低聚糖組成比例相同［4］，即阿魏酸摩爾含量與FOs摩爾含量相同，故本實驗中測定FOs樣品液及其堿解液中阿魏酸含量，換算得出FOs的摩爾含量［12］。

1.2.5.2 FOs堿解處理 分別取不同物理處理下的玉米皮渣酶解液1 mL于10 mL離心管中，添加1 mL濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液，于100℃水解90 min，冷卻后用1 mol/L的鹽酸溶液中和。

1.2.5.3 阿魏酸的液相色譜測定條件 采用AgilentTCC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），30℃，進行HPLC分離，檢測器為紫外檢測器（UV）；洗脫液為0.1%磷酸水（V/V）（A）和乙腈（B），兩者比例為17∶83，流速為1.0 mL/min，進液量為20 μL，檢測波長為320 nm。

1.2.6 其他指標及測定方法

1.2.6.1 細胞壁纖維素含量 細胞壁纖維素水解后采用蒽酮比色法測定［13］。

1.2.6.2 細胞壁果膠含量 細胞壁中果膠先螯合后，再采用蒽酮比色法測定［13］。

1.2.6.3 細胞壁木質素含量 參照李靖等［14］的方法，采用溴乙酰比色法測定。

1.3 統計分析

2 結果與分析

2.1 木質素、纖維素及果膠測定的標準曲線

通過標準曲線測定并繪制，獲得木質素、果膠和纖維素的回歸方程分別為y=0.0644x+0.0171，y=0.008x-0.0152和y=0.0042x-0.0294，各方程的R2分別為0.9907，0.9916和0.9911，可用于樣品中木質素、果膠及纖維素含量的分析。

2.2 玉米皮渣阿魏酰低聚糖的測定

如圖1所示，阿魏酸標準品在液相色譜分析時的出峰時間為8.425 min，采用液相色譜對玉米皮渣酶解獲得的FOs樣液進行分析，發現其阿魏酸的出峰時間段有小峰出現，說明在酶解液中有阿魏酸單體存在，其源于玉米皮渣原料或是物理處理后使阿魏酸

單體釋放仍需后續研究，當用NaOH處理玉米皮渣酶解獲得的FOs樣液時，可見其阿魏酸出峰點的峰形明顯變大，其原因是堿處理使FOs中的阿魏酸酯鍵斷裂，阿魏酸游離析出，故本研究通過測定FOs樣液水解前后阿魏酸的增加量來計算FOs生成量。

圖1 酶解獲得FOs上清液堿解前后及阿魏酸標品液相圖Fig.1 HPLC figures of FOs before and after hydrolysis and HPLC figure of ferulic acid standard

2.3 物理處理對酶解生成FOs生成量的影響

將不同物理處理后的玉米皮渣采用相同量的纖維素酶和木聚糖酶酶解處理，測定酶解產物中FOs的含量，結果如表1所示。

表1 不同物理處理酶解生成FOs量Table1 FOs yield by enzymatic method with maize bran of different physical methods

由表1可知，與原樣（未經物理處理）相比，高壓蒸煮可顯著提高玉米皮渣中FOs的生成量，使其產量提高到原樣的1.5倍；微波處理和膨化處理后FOs產量與原樣相比差異不顯著。報道稱物理處理可促進外源酶對植物細胞壁的水解作用，進而可提高FOs產量；而微波處理和膨化處理使玉米皮渣單位體積下受力或溫度較大，致使玉米皮渣細胞壁結構發生裂解，這有可能使玉米皮渣中存在的阿魏酰低聚糖結構發生破壞［15］，故造成處理后的玉米皮渣再酶解所獲得的FOs產量變化不大。

2.4 物理處理對細胞壁成分的影響

由表2可知，經各處理后，玉米皮渣細胞壁組成發生顯著變化。微波處理和高壓蒸煮使玉米皮渣細胞壁組成中纖維素和果膠含量明顯提高，纖維素含量分別提高為33.48 mg/g和31.62 mg/g，兩者間差異不顯著，但明顯高于未處理的23.99 mg/g，果膠含量由原來的3.54 mg/g分別提高為6.43 mg/g和8.98 mg/g，但木質素含量變化不顯著。原因可能是高壓蒸煮處理主要利用熱效應使玉米皮渣結構壁組成發生改變，在高溫高壓蒸汽作用下，玉米皮細胞壁中果膠質發生溶解，使其含量增加［16］，此結果與本研究中果膠含量規律變化相似。另有報道稱高壓處理可使緊密結合的大分子結構變得更加松散、多孔，顆粒力度減小［17］，故在本研究中高壓蒸煮處理顯著提高了酶解后FOs的生成量。微波處理利用熱效應和空穴效應使玉米皮渣組成發生改變，其中熱效應可能具有與高壓蒸煮相似的作用原理，使得玉米皮細胞壁組成變化相似。膨化處理的作用原理主要是機械效應。機械效應是秸稈在膨化機體內彼此間相互擠壓、摩擦、剪切，于膨化口處突然減壓高速噴射而出，由于運行速度和方向改變而產生很大的內摩擦力。這種內摩擦力加上高溫水蒸汽突然膨大而產生的脹力，使玉米皮撕碎，細胞間木質素分布狀態改變，纖維素中糖苷鍵發生斷裂［18］，使其轉變為小分子可溶性纖維［19］，溶出的纖維素轉變為使得細胞壁中木質素含量相對提高。

表2 不同物理處理時玉米皮渣細胞壁各成分含量Table2 Contents of maize bran cell wall composition treated by different physical methods

2.5 物理處理前后玉米皮渣細胞壁結構變化

對物理處理后的玉米皮渣橫縱切面進行掃描電鏡觀察（圖2），結果顯示不同物理方法處理后，玉米片細胞壁結構發生明顯變化，其中膨化處理使玉米

皮細胞壁結構橫向和縱向均出現斷裂，這與表2中所測玉米皮渣細胞壁組成變化相符，且玉米皮渣細胞壁結構的變化與胡葉碧［20］論文中玉米皮細胞壁結構變化略有相似，由此說明膨化處理使玉米皮渣細胞壁裂解；高壓蒸煮和微波處理后玉米皮細胞壁結構出現明顯膨脹，且高壓蒸煮膨脹效果顯著高于微波處理，原因可能是兩者加熱方式以及加熱強度不同；與原樣相比，高壓蒸煮和微波處理在表面均有不同程度物質的減少，可能是過膠物質溶出造成樣品的缺失，這與表2測定結果相符；此外，微波處理后在玉米皮細胞壁結構中亦有少量斷裂形成，這可能是微波處理的空穴效應造成了樣品中某些物質結構的破壞，其中可能包含有FOs，因而在微波處理后，樣品酶解獲得FOs量未見顯著提高。

圖2 不同物理處理后玉米皮細胞壁結構圖Fig.2 SEM of maize bran cell wall treated by different physical methods

3 結論

物理處理可輔助酶解提高FOs的生成量，其中高壓蒸煮處理可使FOs量提高至原樣的1.5倍，其原因是高壓蒸煮改變了細胞壁組成，提高了外源酶與底物的接觸幾率；微波處理和膨化處理對FOs生成量影響不顯著，原因是兩處理較劇烈，使細胞壁結構裂解同時可能造成FOs的破壞。

［1］Ou JY，Sun Z.Feruloylated oligosaccharides：Structure， metabolism and function［J］.Journal of Functional Foods，2014，7：90-100.

［2］Zhang HJ，Wang J，Liu YL，et al.Wheat bran feruloyl oligosaccharides modulate the phase II detoxifying/antioxidant enzymes via Nrf2 signaling［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2015，74：150-154.

［3］Yuan XP，Wang J，Yao HY.Feruloyl oligosaccharides stimulate growth of Bifidobacterium bifidum［J］.Anaerobe，2005，11：225-229.

［4］Tadashi I.Structure and functions of feruloylated polysaccharides［J］.Plant Science，1997，127：111-127.

［5］Rose DL，Inglett GE，Liu SX.Utilisation of corn（Zea mays）bran and corn fiber in the production of food components［J］.Journal of Food Agriculture，2010，90：915-924.

［6］Wang T，Zhu YD，Sun XH.Effect of microfluidisation on antioxidant properties of corn bran［J］.Food Chemistry，2014，152：37-45.

［7］解春艷，吳智艷，杜娟，等.阿魏酰低聚糖研究進展［J］.食品科學，2012，33（7）：336-340.

［8］張曉民.禾本科植物細胞壁的木質化和阿魏酰化［J］.中國野生植物資源，2011，30（6）：7-13.

［9］張建安，張小勇，韓潤林，等.木素對纖維素酶解的影響及纖維素酶解［J］.化學工程，2000，28（1）：36-39.

［10］潘海曉，劉海順，王靜，等.玉米麩皮中阿魏酰低聚糖的制備［J］.北京工商大學學報：自然科學版，2011，29（3）：33-38.

［11］楊玉華，王運華，杜昌文，等.硼對不同硼效率甘藍型油菜品種細胞壁組成的影響［J］.植物營養與肥料學報，2002，8（3）：340-343.

［12］Xie CY，Wu ZY，Guo HZ，et al.Release of feruloylated oligosaccharides from wheat bran through submerged fermentation by edible mushrooms［J］.Journal of Basic Microbiology，2014，54 （S1）：1-7.

［13］高峻鳳.植物生理學實驗指導［M］.北京：高等教育出版社，2006：149-150.

［14］李靖，程舟，楊曉伶，等.紫外分光光度法測定微量人參木質素的含量［J］.中藥材，2006，29（3）：239-241.

［15］Devin JR，George EI.Production of feruloylated arabinoxylooligosaccharides from maize（Zea mays）bran by microwave-assisted autohydrolysis［J］.Food Chemistry，2010，119：1613-1618.

［16］Niemi P，Faulds C B，Sibakov J，et al.Effect of a milling pretreatment on the enzymatic hydrolysis of carbohydrates in brewer’s spent grain［J］.Bioresource Technology，2012，116：155-160.

［17］申瑞玲，王英.膳食纖維的改性及其對功能特性的影響［J］.農產品加工·學刊，2009（3）：17-20：25.

［18］張祖立，劉曉峰，李永強，等.農作物秸稈膨化技術及膨化機理分析［J］.沈陽農業大學學報，2001，32（2）：128-130.

［19］王大為，郭雪飛，楊羿.高溫高壓擠出處理對玉米皮膳食纖維溶解特性及物性的影響［J］.食品科學，2011，32（13）：84-88.

［20］胡葉碧.改性玉米皮膳食纖維的酶法制備及其降血脂機理研究［D］.無錫：江南大學，2008.

Influence of physical treatment on the yield of feruloyl oligosaccharides from maize bran by enzymatic hydrolysis

XIE Chun-yan1，2，YOU Xue-jiao3，HOU Xiao-qiang1，2，WU Zhi-yan1，2，*，CAO Ge1，DUAN Xiu-xia1
（1.Langfang Teachers University，Life Science College，Langfang 065000，China；2.Applied Technology Researcher Center of Medicinal and Edible Mushroom of Higher Education School of Hebei Province，Langfang 065000，China；3.Microbiology Institute of Guangdong Province，Guangzhou 510000，China）

The influence of physical treatment on the yield of FOs from maize bran was investigated in this paper.In order to explore the function of physical treatment on FOs yield，the changes of composition and structure of maize bran cell wall was determined and the production of FOs was measured.Results indicated that FOs yield was improved 1.5 folds after high pressure steaming，the reason was that the composition of wheat bran cell wall was changed by high pressure steaming，and cellulose and pectin were released，the contact probability of cellulose and xylanase with wheat bran was increased.Cell wall of maize bran was decomposed by microwave treatment and extrusion process，and FOs yield was no obvious change.

maize bran；feruloyl oligosaccharides；physical treatment；enzymatic hydrolysis

TS251.1

B

1002-0306（2016）08-0272-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.048

2015－09－29

解春艷（1983-），女，博士，副教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：xcy8046@163.com。

*通訊作者：吳智艷（1957-），女，碩士，教授，研究方向：微生物，E-mail：lfwuzhiyan@126.com。

河北省教育廳優秀青年基金項目（YQ2013027）；河北省高等學校科學技術研究項目（Z2014049）；河北省高校食藥用菌應用技術研發中心項目（YF201411-321），河北省高等學校遺傳學重點發展學科項目（201221）；廊坊師范學院微生物學重點學科項目（201501）；廊坊師范學院博士基金項目（LSLB201407）。