嗜熱地衣芽孢桿菌植酸酶的原核表達及酶學性質研究

李 平，易 弋，石征宇，伍時華，黃翠姬，黎 婭（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室（廣西科技大學），廣西柳州545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室（廣西科技大學），廣西柳州545006）

嗜熱地衣芽孢桿菌植酸酶的原核表達及酶學性質研究

李 平，易 弋，石征宇，伍時華，黃翠姬，黎 婭*
（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室（廣西科技大學），廣西柳州545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室（廣西科技大學），廣西柳州545006）

將地衣芽孢桿菌SR01（Bacillus licheniformis SR01）的植酸酶phy基因重組于表達載體pGEX-4T-3中，導入大腸桿菌BL21（Escherichia coli BL21）構建工程菌pGX1143，并得到了高效表達。對其酶學性質的研究表明：該酶最適反應pH為5.0，最適反應溫度為55℃，具有廣泛的pH穩定性和較好的熱穩定性；Co2+、Li+、Mg2+和Ba2+對酶活性有促進作用，Cu2+、Pb2+、Fe2+、Ag+、SDS對酶活性有不同程度的抑制作用，并且Pb2+、Fe2+和SDS對酶活性的抑制作用較強烈；此外，該酶還具有非常好的抗胰蛋白酶水解能力和部分抗胃蛋白酶水解的能力。

地衣芽孢桿菌，植酸酶，基因克隆，酶學性質

植酸又名肌醇六磷酸，是谷類、豆類、油料等作物種子中磷的主要貯藏形式，也是飼料中磷的主要存在形式。單胃動物和魚類等因體內缺乏分解植酸所需的酶而難以有效利用植酸磷，從而造成許多問題：高磷糞便污染環境；飼料因添加無機磷導致成本提高；植酸磷與多種金屬離子及蛋白質螯合成不溶性復合物，降低動物對這些營養物質的有效利用等。

植酸酶可使植酸磷降解成肌醇和磷酸，其對動物的飼喂效果已得到廣泛的確證［1］。它能顯著提高動物對飼料中磷的利用率，降低動物排泄物中的磷污染；還可降低植酸的抗營養作用，提高飼料的營養價值［2］。然而植酸酶的抗逆性，尤其是熱穩定性不能完全滿足水產飼料加工要求，這使其不能夠在水產飼料中得到較好的推廣應用［3-4］。

從嗜熱微生物中分離得到耐高溫酶是解決酶熱穩定性的一種重要方法。地衣芽孢桿菌是一種應用潛力良好的菌種，在醫藥、飼料加工、農藥等行業都取得了很好的應用研究成果［5］。本實驗室已從高溫堆

肥中篩選出了一株嗜熱的地衣芽孢桿菌SR01［6］，經初步研究發現其具有植酸酶活性，推測該植酸酶可能具有較好的耐熱性能。本文在此基礎上，克隆其植酸酶基因并在大腸桿菌中得到表達，并對重組植酸酶進行了酶學性質研究，為今后進一步的遺傳改造和工業應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）SR01、大腸桿菌（Escherich coli）BL21、載體PMD-18-T、PGEX-4T-3 廣西工學院發酵工程研究室保存；質粒小提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒 天根生化科技有限公司；TA克隆試劑盒、Ex Taq酶 寶生物工程有限公司；植酸鈉（P3186） Simga公司；LB培養基 見參考文獻［7］。

Tpersonal PCR儀 德國Biometra公司；Micro 220R臺式冷凍離心機 德國HETTICH公司；JYD-650超聲細胞破碎儀 上海之信儀器有限公司；UV-1100紫外/可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建表達載體 根據已發表地衣芽孢桿菌植酸酶基因DNA序列（GeneBank CP000002）設計引物，P1：5’-TTAAACGCAATACCATCCCT-3’，P2：5’-TAA GTGTTATCAAAAGGAGGTT-3’。以地衣芽孢桿菌SR01 DNA為模板，經PCR擴增得到植酸酶基因phyL1，并連接到TA克隆載體pMD18-T上。重組質粒導入E.coli BL21中，通過氨芐青霉素抗性挑選陽性克隆，并對其進行PCR驗證，得到的重組子命名為pTPHYL，交由上海英駿生物技術有限公司測序，并使用Vector NTI 11.0軟件分析測序結果。

根據上述測序結果設計引物，P3：5’-GTCGACA TGAACTTTTACAAAACGCTCGC-3’，P4：5’-GCGGC CGCAACGCAATACCATCCCTCCA-3’，引物中分別引入限制性酶切位點SalⅠ和NotⅠ。以重組子pTPHYL為模板，PCR擴增得到植酸酶基因phyL，產物經SalⅠ和NotⅠ酶切后連接到表達載體pGEX-4T-3上，構建重組質粒，并導入E.coli BL21中。通過氨芐青霉素抗性挑選陽性克隆，利用SalⅠ和NotⅠ酶切驗證陽性轉化子，得到的重組子命名為pGX1143，上交公司測序，進一步確定陽性克隆。

1.2.2 重組植酸酶的表達及檢測 于37℃搖床培養重組菌pGX1143至D600nm到0.6，加入終濃度為0.8 mmol/L 的IPTG于16℃誘導表達12 h后，6000 r/min離心5 min收集菌體，重懸于pH5.0的NaAc-HAc緩沖液（0.1 mol/L NaAc，冰乙酸調節pH至5.0），并進行超聲波破碎（冰浴，200 W，破2 s停2 s，300次），12000 r/min離心15 min，分別收集上清（即粗酶液）和沉淀。然后進行SDS-PAGE檢測目的蛋白，并進行重組蛋白的可溶性分析。

1.2.3 酶學性質分析 植酸酶的活性測定：采用抗壞血酸（VC）-鉬蘭法測定。取0.1 mL粗酶液于離心管中，加入0.9 mL含植酸鈉的緩沖液（4 mmol/L植酸鈉，0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH5.0），于55℃水浴中反應30 min。沸水浴10 min終止反應，加入2 mL VC-鉬酸銨顯色劑顯色（1.5%（w/v）鉬酸銨，3.2%（v/v）H2SO4，0.4%（w/v）抗壞血酸，現配現用），于710 nm波長處測定光密度值。空白對照組設置為先沸水浴使酶失活后再加入底物進行反應。

1.2.3.1 植酸酶的最適反應pH及pH穩定性 將植酸酶粗酶液分別在不同pH條件（pH2～10）下進行酶促反應以測定其最適pH。將粗酶液分別與不同pH的緩沖液混合，于37℃下保溫1 h，然后于55℃、pH5.0的條件下分別測定酶活以比較酶的pH穩定性。以最適條件（55℃，pH5.0）下的酶反應作為酶活100%對照，使用相對酶活比較pH對酶活的影響。

1.2.3.2 植酸酶的最適反應溫度及溫度穩定性 將植酸酶粗酶液分別在不同溫度條件下進行酶促反應以測定其最適溫度。將粗酶液在不同溫度下分別處理0～120 min，然后于55℃、pH5.0的條件下分別測定酶活以比較酶的熱穩定性。以最適條件下的酶反應作為酶活100%對照，使用相對酶活比較溫度對酶活的影響。

1.2.3.3 不同金屬離子和化學試劑對植酸酶活力的影響 在含有底物的NaAc-HAc緩沖液（pH5.0）中分別加入K+、Gr6+、Cu2+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Pb2+、Li+、Zn2+、Fe2+、Ag+以及十二烷基硫酸鈉（SDS）和乙二胺四乙酸（EDTA）（終濃度均為5 mmol/L），并于55℃、pH5.0條件下酶促反應后檢測添加不同離子或化學試劑后的酶活性。以未添加金屬離子和化學試劑的酶反應作為酶活100%對照，使用相對酶活比較金屬離子及化學試劑對酶活的影響。

1.2.3.4 模擬胃腸環境對植酸酶活力的影響 在粗酶液中分別加入模擬胃液（2.0 g/L NaCl，3.2 g/L胃蛋白酶，HCl調節pH至1.2）和模擬腸液（10 g/L胰蛋白酶，50 mmol/L Tris，HCl調節pH至7.4），于37℃溫浴30 min，然后在2 h內分段取樣，于55℃、pH5.0條件下測定酶活性。以未經消化酶處理的酶反應作為酶活100%對照，使用相對酶活比較胃蛋白酶和胰蛋白酶對酶活的影響。

2 結果與分析

2.1 植酸酶基因重組質粒的鑒定

利用引物P3和P4擴增片段全長1229 bp，經Vector NTI 11.0軟件分析，其閱讀框大小為1143 bp，編碼381個氨基酸。序列結果經BLAST對比表明：在核苷酸水平上與所發表的序列（GeneBank CP000002）相似性為98%；在氨基酸水平上與已發表的地衣芽孢桿菌植酸酶相似性為100%。

2.2 重組蛋白的表達

將重組子pGX3138經IPTG誘導后，進行SDSPAGE檢測表達情況，結果見圖1。重組子表達目的蛋白的相對分子質量約為68 ku，與理論值一致，并且目的蛋白在重組子pGX3138誘導后的上清液中大量存在。這說明重組子不僅能夠正確表達目的蛋白，而且目的蛋白的可溶性較好，方便后續的酶學性質研究。

2.3 酶學性質分析

圖1 重組植酸酶表達的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombined phytase expression

圖2 重組植酸酶的最適pHFig.2 Optimum pH of recombined phytase

2.3.1 pH對植酸酶酶活的影響 以pH5.0的NaAc-HAc緩沖液制備植酸酶粗酶液（以下粗酶液獲取方法相同），測定其在37℃時不同pH條件下的催化活性，結果顯示，植酸酶的最適pH為5.0，當pH超過5.5時，酶活力迅速下降，pH8.0時酶活基本喪失。然而用pH8.0的Tris緩沖液（50 mmol/L Tris，濃HCl調節pH至8.0）制備植酸酶粗酶液時，該酶酶活性在pH8.0處表現出第2個活性峰（見圖2）。

pH穩定性方面，將植酸酶在不同pH緩沖液中處理1 h后，實驗結果表明：該酶具有廣泛的pH穩定性，pH5.0～10.0，酶活性仍然保持有80%以上的活性；pH2.0～5.0之間，隨pH減小，酶活性降低，但仍保持有65%以上的活性（見圖3）。由于動物胃內pH約為3，小腸內pH在6～7之間，根據上述結果可以判斷植酸酶在動物消化道內耐酸堿性能較好。

圖3 重組植酸酶的pH穩定性Fig.3 pH-stability of recombined phytase

2.3.2 溫度對植酸酶酶活的影響 重組植酸酶的最適作用溫度是55℃。植酸酶活力在35～55℃之間隨溫度的上升而增強，至55℃時達最大，此后隨溫度的上升而逐漸降低（見圖4）。而且在37℃時，酶活性仍在55%以上，說明該酶在動物體內也能保持一定的活性。

圖4 重組植酸酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature of recombined phytase

在熱穩定性方面，如圖5所示，重組植酸酶在低于60℃處理2 h，其酶活性殘留量仍能夠保持在75%以上；超過70℃處理30 min，酶活性迅速下降；達到90℃時，處理30 min，酶活性能保持在20%左右；在90℃處理60 min后，酶活性基本喪失。

圖5 重組植酸酶的溫度穩定性Fig.5 Thermostability of recombined phytase

圖6 金屬離子及化學試劑對重組植酸酶酶活的影響Fig.6 Effect of metal ions on activity of recombined phytase

2.3.3 金屬離子及化學試劑對植酸酶活性的影響 在酶促反應體系中加入不同的金屬離子和化學試劑后分別測定酶活性，以未添加金屬離子和化學試劑的酶促反應作為對照。結果表明，Co2+、Li+、Mg2+和Ba2+對

植酸酶有輕微的激活作用；K+、Gr6+、Mn2+、Ca2+、Zn2+和EDTA對酶活影響不大，酶活力都在100%左右；Cu2+、Pb2+、Fe2+、Ag+、SDS對植酸酶的酶促反應均有不同程度的抑制作用，其中Pb2+、Fe2+和SDS對酶活性的抑制作用較強，酶活力均在40%以下（如圖6）。

2.3.4 模擬胃腸環境對酶活的影響 植酸酶經模擬胃液處理2 h以后，酶活性仍剩余58.5%。而經模擬腸液處理后，酶活性曲線呈緩慢上升狀態，2 h后酶活性提高了15%（見圖7）。這說明phy植酸酶具有非常優秀的胰蛋白酶抗逆性和較好的胃蛋白酶抗逆性。

圖7 重組植酸酶抗胃蛋白酶和胰蛋白酶活性曲線Fig.7 Activity curves of recombined phytase resistant to pepsin and trypsin

3 討論

近年來，關于植酸酶對胃腸道消化酶耐受性的研究報道逐漸增多。據研究結果顯示，植酸酶對胃蛋白酶有不同程度的耐受性，胰蛋白酶對植酸酶酶活的抑制作用一般比胃蛋白酶大［8-10］。本研究發現，經胃蛋白酶處理2 h后，該酶活性有60%左右；但經胰蛋白酶處理2 h后該酶活性反而提高了15%。Zhu等［11］研究表明，植酸酶經胰蛋白酶處理后，酶活性有顯著提升。Jesus等［12］也有類似發現，經胰蛋白酶處理后酶活提高了30%左右。其原因可能是模擬腸液中含有提高植酸酶酶活的物質，或者植酸酶被水解的小片段中有比未經胰蛋白酶作用的植酸酶酶活性更高的抗胰蛋白酶多肽存在。

以pH5.0的緩沖液制備的植酸酶粗酶液只在pH5.0處有一個活性峰。用pH8.0的緩沖液破胞制備的植酸酶粗酶液，卻在pH5.0和8.0處，表現有兩個活性峰，這與黃敏［13］發現的重組大腸桿菌植酸酶、Thamy［14］發現的黃青霉植酸酶顯示出pH雙活性峰類似。這一現象顯示不同pH的破胞液對植酸酶酶活可能產生影響，其原因可能是該植酸酶在pH5.0和pH8.0環境下的酶空間結構不同，而且pH8.0處該酶結構變化是可逆轉的，pH5.0處該酶空間結構的變化則是不可逆轉的，因而以pH5.0緩沖液制備的植酸酶粗酶液在pH8.0處喪失活性。

本實驗發現，Co2+對該酶有輕微的激活作用，這一現象與已報道的結果有所不同，其研究結果均顯示Co2+對植酸酶有較強的抑制作用［15-16］；Pb2+、Fe2+對酶活性有較強的抑制作用。Ullah［17］認為Cu2+、Fe2+、Pb2+等離子可和酶底物植酸發生絡合作用，形成難溶的復合物，降低了植酸的有效濃度，從而酶的活性降低；Yu等［16］則認為這些金屬離子改變了酶的結構，如硫巰基（-SH），而使酶活降低。EDTA對該植酸酶酶活幾乎沒有影響，這說明該酶并不需要任何金屬離子作為其輔助因子［18］。不同來源的植酸酶之間也存在差異，可能是由于其植酸酶結構不同，因而與金屬離子結合方式也有所不同。

4 結論

本研究成功克隆了一株嗜熱地衣芽孢桿菌SR01的植酸酶基因，并在大腸桿菌中得到高效表達。該重組植酸酶最適pH為5.0，最適溫度為55℃，而且在37℃時，酶活性仍在55%以上，具有廣泛的pH穩定性和較好的熱穩定性，且擁有較好的胃蛋白酶抗性和優秀的胰蛋白酶抗性。這些特點一方面使其在飼料工業等領域具有較好的應用潛力；另外該酶也可作為基因材料用于植酸酶的蛋白質工程研究，了解結構與功能的關系，獲得性質更為優良的植酸酶突變體。

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Expression and characteristics of phytase from Bacillus licheniformis

LI Ping，YI Yi，SHI Zheng-yu，WU Shi-hua，HUANG Cui-ji，LI Ya*
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

The gene phy，from a thermophilic bacteria strain Bacillus licheniformis SR01，was cloned into prokaryotic expression vector pGEX-4T-3 to construct the recombinant strain pGX1143，and it was successfully efficiently expressed.The optimal pH and temperature for this phytase activity were 5.0 and 55℃，respectively.The enzyme had a wide range of pH stability and good thermal stability.And it was activated by Co2+，Li+，Mg2+，Ba2+，and inhibited by Cu2+，Pb2+，Fe2+，Ag+，SDS.However，it almost lost activity when influenced by Pb2+，Fe2+and SDS.In addition，it had strong ability to resist hydrolyzation by trypsin and partial ability to resist hydrolyzation by pepsin.

Bacillus licheniformis；phytase；gene cloning；enzymatic characterization

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0238-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.041

2015－10－08

李平（1990－），男，碩士研究生，研究方向：分子生物學與酶工程，E-mail：lpwater@yeah.net。

*通訊作者：黎婭（1980－），女，碩士，講師，研究方向：微生物學領域，E-mail：liya0807@163.com。

廣西科學基金（2014GXNSFAA118086）；廣西科學基金（2015GXNSFBA139068）。