芎柰抗骨關節炎有效部位研究

郭嘉俊，張小靈，張慧迪，時軍（廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州510006）

芎柰抗骨關節炎有效部位研究

郭嘉俊，張小靈，張慧迪，時軍
（廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州510006）

目的研究川芎山柰抗關節炎作用的有效部位。方法利用小鼠熱板法、乙酸扭體法和二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型，比較芎柰水提物、醇提物的抗炎鎮痛作用；采用木瓜蛋白酶誘導大鼠骨關節炎模型，比較不同溶劑萃取物的抗炎作用。結果在相同劑量下，芎柰醇提物鎮痛作用較水提物強（P＜0.05）；芎柰醇提物乙酸乙酯萃取物能有效減輕骨關節炎大鼠踝關節寬度和足趾腫脹（P＜0.01），顯著降低血清IL-1β和NO水平（P＜0.01），改善其病理學改變。結論芎柰醇提物具有明顯的抗炎鎮痛作用，其乙酸乙酯部位是芎柰抗關節炎的最有效部位。

芎柰；抗骨關節炎；有效部位

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是臨床上常見的一種退變性關節病，發病率約為總人口的15%，主要表現為持續性的關節疼痛，病情嚴重者可導致肌肉萎縮及關節畸形［1］。中醫學稱OA為骨痹，病因肝腎虧虛、風寒濕邪侵襲、淤血痰濁所致，屬本虛標實之證。目前臨床治療OA，常用手術治療和藥物治療，手術治療較為痛苦，化學藥物以改善癥狀為主，但不宜長期使用，并難以從根本上逆轉OA的病理發展［2］。中醫藥治療OA主要從祛風散寒、活血化瘀、行氣止痛入手，療效確切。川芎和山柰是常用的行氣止痛藥，據報道，川芎和山柰經陳醋浸泡，粉末局部貼敷，治療OA療效顯著［3］。本研究從醋炙川芎和山柰入手，篩選抗OA的有效部位，為開發芎柰透皮制劑提供科學依據。

1　材料

1.1主要儀器

501超級恒溫水浴（金壇市宏華儀器廠）；打孔器（北京眾實迪創科技發展有限責任公司）；PV-200足趾容積測量儀（成都泰盟科技有限公司）；游標卡尺（上海恒勝工具有限公司）；OLYMPUS CKX41（日本Olympus光學儀器有限公司）；ELX800全自動酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.2試藥

川芎Ligusticum chuangxiong Hort、山柰Kaempferia galanga L均購自安徽歸然藥業，批號20150817，經廣東藥科大學中藥學院中藥資源系馬鴻雁副教授鑒定為2015年版中國藥典正品；陳醋（山西四眼井釀造實業有限公司，批號20150910）；木瓜蛋白酶（上海藍季生物有限公司，批號140314）；雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（北京諾華制藥有限公司，批號X4014）；NO試劑盒（上海通蔚實業有限公司，批號201508）；IL-1β試劑盒（上海通蔚實業有限公司，批號201508）；二甲苯、冰乙酸、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇等試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3實驗動物

SPF級KM小鼠（20±2）g，雌雄各半，廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（粵）2015-0004；SPF級SD大鼠（200±20）g，雌雄各半，廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（粵）2015-0020。

2　方法

2.1樣品的制備

分別稱取川芎、山柰飲片適量，按5∶1的比例醋炙后，晾干。稱取醋炙芎柰適量，粉碎成粗粉，分別用10倍量的70%（φ）乙醇和蒸餾水加熱回流提取3次，每次提取2 h，濾過，合并各提取液，減壓回收乙醇和水，得到芎柰醇提物浸膏（得率42.15%）和水提物浸膏（得率61.92%）。取芎柰醇提物浸膏適量，用蒸餾水分散后，按1∶1的比例依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并各萃取液，減壓回收各有機試劑及水，濃縮，得到石油醚萃取物（得率2.38%）、乙酸乙酯萃取物（得率2.05%）、正丁醇萃取物（得率2.55%）及剩余水層物（得率31.38%）。

2.2二甲苯所致小鼠耳廓腫脹實驗［4］

取小鼠72只，雌雄各半，隨機分為6組，分別為空白組、扶他林2.00 g/kg組、醋炙芎柰水提物高、低劑量組（74.30、37.15 g/kg），醋炙芎柰水提物高、低劑量組（50.58、25.29 g/kg）。適應性喂養2 d后給藥。給藥前1 d，將小鼠背部脫毛約4 cm×2 cm。實驗時，將實驗藥品加適量凡士林，敷在小鼠背部脫毛皮膚上，攤成約4 cm×2 cm×0.1 cm的薄片，空白組給予適量凡士林，每天給藥1次，連續給藥7 d。末次給藥后1.5 h，右耳廓兩面滴二甲苯溶液每耳30 μL致炎，20 min后，脫頸臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑0.6 cm打孔器取左右耳廓同一部位圓耳片，電子天平稱質量，計算兩耳廓片質量之差為腫脹度。

2.3乙酸所致小鼠扭體反應實驗［4］

取小鼠72只，雌雄各半，隨機分為6組，按照“2.1”小鼠給藥方法，每天給藥1次，連續給藥7 d。于末次給藥后1.5 h，給予每只小鼠腹腔注射0.6% （φ）冰乙酸10 mL/kg，觀察小鼠15 min內的扭體次數（腹部內凹、伸展后肢、臀部抬高）。

2.4熱刺激所致小鼠疼痛反應實驗［4］

取雌性小鼠72只，先用熱板進行合格小鼠篩選，調節溫度（55±0.5）℃，取給藥前痛閾值在5～30 s內的合格小鼠，隨機分為6組，按照“2.1”給藥方法，每天給藥1次，連續給藥7 d。于末次給藥30、60、90 min后分別記錄小鼠給藥后的痛閾值，計算痛閾值提高百分率。

2.5木瓜蛋白酶所致OA模型大鼠實驗

2.5.1大鼠OA模型的制備及給藥 取大鼠42只，雌雄各半，隨機分為7組，分別為正常對照組、模型組、扶他林0.67 g/kg組、石油醚萃取物1.43 g/kg組、乙酸乙酯萃取物1.23 g/kg組、正丁醇萃取物1.53 g/kg組、剩余水層物18.83 g/kg組。適應性喂養2 d后，開始造模。造模前1 d，將大鼠左后足膝關節以下脫毛，分別在第2、5、8天于模型組和各給藥組大鼠左后足跖皮內注射0.1 mL 4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液，誘導OA大鼠模型，正常對照組大鼠左后足跖皮內于上述時間點注射等量生理鹽水，術后不固定傷肢，自由活動。造模成功后，將實驗藥品加適量凡士林，敷在大鼠左后足脫毛皮膚上，正常對照組給予適量凡士林，每天給藥2次，連續給藥4周。2.5.2 觀察指標 觀察各組大鼠的攝食量、活動情況、毛色、大小便等；測量造模前后每周大鼠體質量；分別于給藥第1、2、3、4周求出大鼠的關節腫脹度和足趾腫脹度。用游標卡尺測量大鼠左后踝關節的寬度，用足趾容積測量儀測量大鼠左后踝關節以下的容積，測量3次取平均值，按照以下公式求出關節腫脹度和足趾腫脹度。

關節腫脹度（mm）=致炎后踝關節寬度-致炎前踝關節寬度

足趾腫脹度（mL）=致炎后左后踝關節以下的容積-致炎前左后踝關節以下的容積

2.5.3血清中IL-1β、NO指標測定 連續給藥4周后，腹主動脈采血，分離血清，用ELISA法分別測定血清中的IL-1β和NO含量，操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.5.4病理切片觀察 大鼠腹主動脈采血后，剝離左后踝關節，10%（φ）甲醛固定，10%EDTA脫鈣，常規包埋，切片，HE染色后光鏡下觀察病理組織學變化。2.6 統計學分析

3　結果

3.1芎柰水提物和醇提物的抗炎鎮痛作用

與空白組比較，扶他林組、芎柰水提物高、低劑量組，醇提物高、低劑量組的耳廓腫脹度水平均明顯降低（P＜0.01），醇提物組優于水提物組（P＜0.05）；與空白組比較，扶他林組、水提物高劑量組，醇提物高、低劑量組的痛閾提高百分率水平均明顯提高（P ＜0.01），醇提物組優于水提物組（P＜0.05），水提物低劑量組在30、60 min均能提高（P＜0.05），但在90 min時痛閾提高百分率差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組比較，扶他林組、水提物高、低劑量組、醇提物高、低劑量組的扭體次數水平均明顯提高（P＜0.01），醇提物組優于水提物組（P＜0.01），水提物低劑量組扭體次數差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

3.2芎柰不同極性溶劑萃取物的抗OA作用

3.2.1一般情況觀察 各組大鼠在攝食量、活動情況、毛色、大小便等方面無明顯差異。造模前后每周測量大鼠體質量，同實驗階段大鼠體質量差異無統計學意義。

3.2.2大鼠關節腫脹度的變化 與模型組比較，扶他林組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組從第2周起能顯著減少關節腫脹度（P＜0.01），乙酸乙酯萃取物組優于正丁醇萃取組（P＜0.05）；石油醚萃取物組和剩余水層組的關節腫脹度差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1　芎柰水提物和醇提物的抗炎鎮痛作用比較Table 1 Effect of water and alcohol extracts from Xiongnai on anti-inflammation and analgesia（，n=12）

表1　芎柰水提物和醇提物的抗炎鎮痛作用比較Table 1 Effect of water and alcohol extracts from Xiongnai on anti-inflammation and analgesia（，n=12）

組別　　劑量/ （g·kg-1）耳廓腫脹度/ mg痛閾提高百分率/%扭體次數30 min　60 min　90 min空白組　-　19.83±5.94##　17.52±2.51#　20.51±13.63#　20.26±5.82　38.33±2.27##扶他林組　2.00　8.27±3.32**##　97.15±31.13**##109.62±30.56**##　96.58±28.31**##　19.55±1.97**##水提物組　74.30　12.08±3.09**　52.37±13.11**　60.69±23.92**　55.71±25.33**　29.08±1.68**37.15　14.92±4.34**　39.62±8.07*　48.32±12.45*　39.02±11.69　34.83±1.19**醇提物組　50.58　10.36±5.10**#　86.96±9.13**##　91.53±10.36**#　87.06±12.24**##　22.27±1.27**##25.29　11.50±3.85**　64.07±19.88**#　74.30±25.56**#　65.60±25.80**#　26.33±1.50**##

表2　芎柰不同萃取物的大鼠關節腫脹度比較Table 2 Effect of different extracts of Xiongnai on articular swelling in rats with osteoarthritis（，n=6）

表2　芎柰不同萃取物的大鼠關節腫脹度比較Table 2 Effect of different extracts of Xiongnai on articular swelling in rats with osteoarthritis（，n=6）

組別　　劑量/ （g·kg-1）關節腫脹度/mm給藥前　　第1周　　第2周　　第3周　　第4周正常對照組　-　0.065±0.025△△**0.083±0.047△△**　0.023±0.034△△**　0.027±0.027△△**　0.025±0.021△△模型組　-　1.142±0.160　1.262±0.174　1.227±0.250**　1.460±0.364**　1.410±0.476**扶他林組　0.67　1.115±0.177　0.588±0.179△△*　0.240±0.243△△**　0.142±0.156△△**　0.137±0.108△△石油醚萃取物組　1.43　1.150±0.186　1.398±0.194*　1.515±0.241**　1.355±0.338**　1.267±0.300**乙酸乙酯萃取物組　1.23　1.383±0.507　0.900±0.489△　0.367±0.231△△*　0.222±0.125△△**　0.092±0.053△△正丁醇萃取物組　1.53　1.232±0.341　1.005±0.365　0.752±0.282△△　0.655±0.275△△　0.295±0.152△△剩余水層物組　18.83　1.190±0.120　1.423±0.187*　1.327±0.339**　1.187±0.296**　1.390±0.231**

表3　芎柰不同萃取物的大鼠足趾腫脹度比較Table 3 Effect of different extracts of Xiongnai on toe swelling in rats with osteoarthritis（，n=6）

表3　芎柰不同萃取物的大鼠足趾腫脹度比較Table 3 Effect of different extracts of Xiongnai on toe swelling in rats with osteoarthritis（，n=6）

與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01；與正丁醇萃取物組比較:*P＜0.05，**P＜0.01。

組別　　劑量/ （g·kg-1）足趾腫脹度/mL給藥前　　第1周　　第2周　　第3周　　第4周正常對照組　-　0.060±0.047△△**0.077±0.046△△**　0.047±0.035△△**　0.058±0.047△△*　0.052±0.049△△模型組　-　0.287±0.169　0.277±0.153　0.385±0.174**　0.423±0.166**　0.373±0.239**扶他林組　0.67　0.285±0.145　0.153±0.088△*　0.082±0.028△△*　0.123±0.082△△　0.087±0.068△△石油醚萃取物組　1.43　0.280±0.058　0.277±0.081　0.355±0.095　0.308±0.135　0.287±0.080*乙酸乙酯萃取物組　1.23　0.270±0.069　0.140±0.076△△*　0.092±0.052△△*　0.082±0.029△△　0.050±0.020△△正丁醇萃取物組　1.53　0.280±0.081　0.268±0.099　0.212±0.099△△　0.190±0.109△△　0.147±0.114△△剩余水層物組　18.83　0.283±0.053　0.278±0.053　0.295±0.062　0.308±0.043　0.257±0.078

3.2.3大鼠足趾腫脹度的變化 與模型組比較，扶他林組、乙酸乙酯萃取物組第1周足趾腫脹度減少（P＜0.05），從第2周起，扶他林組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組足趾腫脹度均明顯減少（P＜0.01），乙酸乙酯萃取物組優于正丁醇萃取組（P＜0.05）；石油醚萃取物組和剩余水層組的足趾容積變化差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

3.2.4大鼠血清IL-1β與NO含量的變化 與模型組比較，扶他林組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組能顯著減少大鼠血清中IL-1β、NO含量（P＜0.01），石油醚萃取物組和剩余水層物組血清IL-1β、NO含量差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4　芎柰不同萃取物的大鼠血清中IL-1β與NO含量比較Table 4 Effect of different extracts of Xiongnai on the serum levels of IL-1β and NO in rats with osteoarthritis （，n=6）

表4　芎柰不同萃取物的大鼠血清中IL-1β與NO含量比較Table 4 Effect of different extracts of Xiongnai on the serum levels of IL-1β and NO in rats with osteoarthritis （，n=6）

與模型組比較:△△P＜0.01。

組別　　劑量/ （g·kg-1）ρ（IL-1β）/ （ng·L-1）ρ（NO）/ （ng·L-1）正常對照組　-　44.99±3.38△△32.00±4.35△△模型組　-　106.53±6.25　46.87±4.05扶他林組　0.67　52.73±6.74△△36.25±3.48△△石油醚萃取物組　1.43　100.69±11.23　46.40±1.71乙酸乙酯萃取物組　1.23　59.63±3.47△△40.19±5.32△△正丁醇萃取物組　1.53　60.67±6.92△△40.41±2.16△△剩余水層物組　18.83　101.12±6.93　46.80±4.72

3.2.5芎柰不同萃取物對OA大鼠踝關節病理的影響 正常對照組大鼠左踝關節滑膜組織中沒有炎癥細胞浸潤，關節軟骨沒有受到破壞；模型組、石油醚萃取物組、剩余水層組的大鼠左踝關節滑膜組織中出現大量炎性細胞，關節腔間隙變窄，關節軟骨發生破壞；扶他林組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組可見少量炎性細胞，關節間隙稍變窄，關節軟骨未見明顯破壞。見圖1。

圖1　芎柰不同萃取物對OA模型大鼠踝關節損傷的影響（HE，100×）Figure 1 Effects of different extracts of Xiongnai on ankle injury in rats with osteoarthritis（HE，100×）

4　討論

目前，用于治療OA的化學藥物常用非甾體類抗炎藥物，可以有效改善膝關節疼痛、腫脹，但不能從根本上逆轉OA的病理發展，且長期服用易導致消化道與腎臟的不良反應，因而僅在急性期使用［5］。糖皮質激素對中晚期OA有良好的作用，但多次注射加重骨關節的損害［6］。改善軟骨代謝藥物硫酸軟骨素等能有效緩解軟骨退變，強化軟骨結構，延緩OA發展，但也存在一定的不良反應，對于OA的治療價值有待進一步研究與探討［7］。

疼痛和關節僵直是OA的兩大典型癥狀。OA的藥效實驗常用誘發模型及自發模型［8］，其檢測指標主要有與組織結構性成分有關的指標和分子標志物，包括膠原、蛋白聚糖、金屬蛋白酶系統、細胞因子、炎癥信息分子等［9］。本文運用抗炎鎮痛實驗，證明醋炙芎柰醇提物優于水提物；并運用醋炙芎柰不同極性溶劑萃取物進行抗OA實驗，選擇血清中的細胞因子IL-1β和NO為檢測指標，結合病理切片，證明乙酸乙酯部位是醋炙芎柰的最有效部位。

研究發現，川芎中川芎嗪、阿魏酸、大黃酸均具有抗炎等作用，均能明顯降低OA模型大鼠/小鼠的關節液、血液中NO含量水平，阿魏酸還能降低關節液、血漿中丙二醛（MDA）水平，增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，對減輕OA炎癥有一定的作用［10-12］。山柰中的山柰酚、蘆丁能夠通過抑制NO的產生從而降低炎癥反應中TNF-α等促炎性因子的表達來達到抗炎的效果［13-14］。川芎山柰乙酸乙酯部位抗OA活性，是否是這些成分的整體協同作用，以及具體的抗OA作用機制，有待進一步研究。

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（責任編輯：幸建華）

Study of the effective parts of Xiongnai on anti-osteoarthritis

GUO Jiajun，ZHANG Xiaoling，ZHANG Huidi，SHI Jun
（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the effective parts of Xiongnai on anti-osteoarthritis.Methods Three kinds of mice models including hot-plate test，acetic acid-caused writhing response and xylene-induced ear swelling were used to test the activity of water and alcohol extracts from Xiongnai on anti-inflammatory and analgesic effects.The rat model of papain-induced osteoarthritis was used to test the effect of different solvent extracts on anti-inflammatory effects.Results Alcohol extract from Xiongnai displayed a better anti-inflammatory and analgesic effects than that in water extract under the same dose.The ethyl acetate group effectively relieved the width of the ankle and toes swelling（P＜0.01），decreased the serum levels of IL-1β and NO （P＜0.01），and improved the pathology damage.Conclusion The alcohol extract of Xiongnai exhibits an apparent anti-inflammatory and analgesic activity，and the ethyl acetate extract of Xiongnai is the most effective part on anti-osteoarthritis.

Xiongnai；anti-osteoarthritis；effective parts

R285

A

1006-8783（2016）04-0470-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016042702

2016-04-27

廣東省科技攻關計劃項目（2014A020212417）

郭嘉?。?991—），男，2014級碩士研究生，Email:guojj3354@163.com；通信作者:時軍（1980—），男，博士，副教授，主要從事中藥新藥及制劑新技術研究，電話:020-39352169，Email:shijun8008@163.com。

網絡出版時間:2016-07-11 14:29:40 網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1429.003.html