青莢葉多酚超聲波輔助提取工藝及抗氧化活性研究

孫志武,李　寧,李　好,李紅萍,*

(1.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河南鄭州 450001;2.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院,河南鄭州 450001)

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青莢葉多酚超聲波輔助提取工藝及抗氧化活性研究

孫志武1,李寧2,李好1,李紅萍2,*

(1.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河南鄭州 450001;2.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院,河南鄭州 450001)

確定超聲波輔助提取青莢葉多酚的最佳工藝條件及其體外抗氧化活性。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,固定超聲功率65 W,提取次數(shù)2次,通過響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)提取多酚的工藝參數(shù),并對其抗氧化活性進(jìn)行測定分析。結(jié)果表明:超聲輔助提取青莢葉多酚的最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)40.8%、提取時間4.8 min、料液比1∶60 (g∶mL)、提取溫度67.5 ℃,多酚提取量為29.43 mg/g。青莢葉多酚具有較強(qiáng)的還原能力,清除DPPH自由基和ABTS+·自由基IC50分別為44.28、35.07 mg/L。因此,青莢葉可作為潛在天然抗氧化劑應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中。

青莢葉,多酚,超聲輔助,響應(yīng)面法,抗氧化

青莢葉(HeLwingiajaponica)為山茱萸科青莢葉屬落葉灌木,因雌花無梗,生于葉脈中部而得名,主要分布于亞洲東部和東南部的一些國家和地區(qū)。在《植物名實(shí)圖考》中,青莢葉又稱為陰證藥、大部參,植株各部位均可入藥,具有活血消腫、清熱解毒等功效[1]。青莢葉富含人體必需的氨基酸、不飽和脂肪酸、多糖、多酚類等生物活性成分,是一種藥食同源的新資源食品[2],且在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)也有廣泛的用途,是極其寶貴的自然資源。多酚是重要的植物次級代謝產(chǎn)物,大量研究結(jié)果表明,植物多酚能顯著的清除人體內(nèi)自由基,具有抗氧化、抗心血管疾病、抗菌和抗癌等生物學(xué)功效[3-4]。近年來,以植物多酚為原料的營養(yǎng)和保健食品需求量日益增多。青莢葉作為一種藥食同源的新資源食品,目前對其的研究主要集中在觀賞和種植、藥用價(jià)值、化學(xué)成分及多糖提取等方面,對青莢葉中具有營養(yǎng)和保健功能的多酚類物質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。超聲輔助提取天然產(chǎn)物活性成分分離技術(shù),利用超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)加速原料細(xì)胞壁的破碎,增加溶劑的穿透力,從而加速細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出、釋放和擴(kuò)散,具有操作簡單、提取效率高、節(jié)省溶劑等特點(diǎn)[5-7],近年來已逐漸被應(yīng)用到天然植物活性成分的提取。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲輔助提取青莢葉多酚(HelwingiajaponicaPolyphenols,以下簡寫為HLJP)的提取工藝,并對HLJP的體外抗氧化活性進(jìn)行測定分析,為青莢葉資源的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

青莢葉新鮮野生,2013年6月采自河南省伏牛山脈盧氏縣獅子坪原始森林;正己烷、沒食子酸、無水乙醇、鹽酸、無水碳酸鈉、福林試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等試劑均為國產(chǎn)分析純級,所用水均為二次蒸餾水。

UV-1750紫外可見分光光度計(jì)島津國際貿(mào)易(上海)有限公司;BILON-650CT多用途超聲波提取機(jī)上海比朗儀器有限公司;BILON-W-530B低溫恒溫槽北京比朗實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀鞏義予華設(shè)備有限責(zé)任公司;TG-16高速離心機(jī)鞏義科華設(shè)備有限責(zé)任公司;PHS-3C酸度計(jì)上海雷磁儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HLJP提取工藝流程青莢葉→清洗→低溫干燥→粉碎→索氏提取法(正己烷為溶劑)脫脂→低溫真空干燥→超聲(65 W)輔助浸提→6000 r/min離心30 min取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→定容→測定吸光度→計(jì)算HLJP提取量。

1.2.2多酚含量的測定采用福林酚法[8]進(jìn)行測定,以沒食子酸溶液為標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)吸光值與沒食子酸濃度建立回歸方程為Y=0.0896X+0.0221(Y:吸光值;X:沒食子酸溶液濃度;R2=0.9985)。多酚提取量按公式(1)計(jì)算:

式(1)

式中:C為HLJP質(zhì)量濃度(mg/mL);V為HLJP提取液體積(mL);m為青莢葉樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3HLJP提取工藝優(yōu)化根據(jù)已做的超聲輔助提取HLJP單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、料液比和提取溫度,進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),所取各因素及水平見表1。以HLJP提取量為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件。

1.2.4HLJP對Fe3+還原能力測定配制不同濃度梯度的樣品溶液(50、100、150、200、250、300 mg/L),依次在比色管中加入樣品1.00 mL、磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)1.0 mL、鐵氰化鉀溶液(1%)1.0 mL,混勻,50 ℃恒溫水浴30 min,取出冷卻至室溫,加入1.0 mL三氯乙酸溶液(10%),混勻,4000 r/min離心20 min,移取1.00 mL上清液至另一具塞試管中,加入2.0 mL水和1.0 mL三氯化鐵溶液(0.1%),搖勻后室溫靜置10 min,測定液體在波長700 nm處的吸光度,以維生素C(50、100、150、200、250、300 mg/L)做標(biāo)準(zhǔn)對照品[9-10]。

表1　Box-Behnken中心組合因素水平表Table 1　Factors and levels of Box-Behnken central composite experimental design

1.2.5DPPH·清除能力的測定配制不同濃度梯度的樣品溶液(5、25、50、75、100、125 mg/L),依次在10 mL的比色管中加入樣品2.00 mL,磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.88)4.0 mL,0.1 mmol/L DPPH·溶液2 mL,搖勻,避光反應(yīng)30 min,以95%的乙醇溶液作參比,在517 nm處測定溶液的吸光度[11],以維生素C(5、25、50、75、100、125 mg/L)做標(biāo)準(zhǔn)對照品,無水乙醇做空白對照。自由基清除率計(jì)算公式為(2):

式(2)

式中:Y為DPPH·清除率,A0為空白對照溶液吸光度,AS為樣品溶液吸光度,AS0為未加DPPH·溶液的本底吸光度。

1.2.6ABTS+·清除率測定將7 mmol/L ABTS溶液5 mL和140 mmol/L過硫酸鉀溶液88 μL混合產(chǎn)生ABTS+·,室溫下避光靜置反應(yīng)12～16 h,即得到ABTS+·溶液。使用時用水稀釋ABTS+·溶液定容至500 mL,使其在734 nm處的吸光度為0.700±0.02[12]。依次在10 mL的比色管中加入0.50 mL不同濃度梯度的樣品溶液(5、15、25、50、60、65 mg/L)、5.5 mL的ABTS+·溶液,混勻,在37 ℃水浴中保溫20 min,測定其在734 nm處吸光度,以維生素C(以下簡稱VC)(5、15、25、50、60、65、70、75 mg/L)做標(biāo)準(zhǔn)對照品。以純水做為空白對照。樣品抗氧化能力以其對ABTS+·的清除率Y來表示,計(jì)算公式同式(2)。式中:Y為ABTS+·清除率,A0為空白對照溶液吸光度,AS為樣品溶液吸光度,AS0為未加ABTS+·溶液的本底吸光度。

1.2.7數(shù)據(jù)處理運(yùn)用Design-Expert.V8.0.6.1和origin9.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析并作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1響應(yīng)面法優(yōu)化青莢葉提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇4個對HLJP提取量影響較為顯著的因素(X1為乙醇體積分?jǐn)?shù),X2為超聲時間,X3為料液比,X4為提取溫度),依據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行4因素3水平的中心組合設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Box-Behnken central composite experimental design and the results

運(yùn)用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對表2中數(shù)據(jù)擬合,得到多酚提取量的二次多元回歸模型方程為:

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3,回歸模型p<0.0001,模型極其顯著。失擬項(xiàng)p=0.3603>0.05,失擬不顯著。用該模型分析、預(yù)測超聲輔助提取HLJP的結(jié)果見表2。模型中,除X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4外,其他項(xiàng)p<0.05,表明這些項(xiàng)對HLJP提取量的影響均達(dá)到顯著水平。

根據(jù)回歸方程所繪制的響應(yīng)曲面見圖1,依據(jù)曲面的陡峭程度,可判斷料液比X3、乙醇體積分?jǐn)?shù)X1、提取溫度X4對HLJP提取量影響均較為顯著。結(jié)合表3數(shù)據(jù),可知X1X2、X2X3的交互作用對HLJP提取量的影響顯著,X1X4、X3X4、X2X4、X1X3的交互作用對HLJP提取量的影響不顯著,比較各因素F值大小,判斷各因素對HLJP提取量影響的順序?yàn)?料液比X3>乙醇體積分?jǐn)?shù)X1>提取溫度X4>超聲時間X2。

表3　回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3　Analysis of variance for regression equation

注:* 差異顯著,p<0.05;** 差異極顯著,p<0.01。

圖1　各因素的交互作用對HLJP提取量影響的響應(yīng)曲面Fig.1　Response surface of different factors on HLJP yield

通過Design-Expert.V8.0.6.1軟件分析,HLJP提取最佳工藝條件是:乙醇體積分?jǐn)?shù)40.8%,提取時間4.8 min,料液比1∶60 g∶mL,提取溫度67.5 ℃,在此條件下,HLJP的預(yù)測提取量為29.58 mg/g,五組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得的HLJP平均提取量為29.43 mg/g,預(yù)測值和驗(yàn)證值誤差在±1%以內(nèi),由此可知,響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件可靠。

2.2HLJP的抗氧化性分析

2.2.1HLJP對Fe3+還原能力測定在還原能力分析中,反應(yīng)產(chǎn)物在700 nm波長處的吸光度越大,樣品的還原能力越大[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2,隨著濃度的增大,HLJP和VC對Fe3+還原能力逐漸增強(qiáng),存在明顯的量效關(guān)系。比較相同濃度下的吸光度可知,HLJP的還原能力強(qiáng)于維生素C。

圖2　HLJP對Fe3+的還原能力Fig.2　The reducing power of HLJP to Fe3+

2.2.2HLJP對DPPH·清除率測定通過測定物質(zhì)對DPPH·的清除能力,可以快速的評價(jià)物質(zhì)的抗氧化性[14-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3,隨著溶液濃度的增大,HLJP和維生素C對DPPH·清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)清除劑濃度達(dá)到80 mg/L時,HLJP和VC對DPPH·的清除率增速變緩。較高濃度時,HLJP對DPPH·清除能力要明顯強(qiáng)于VC。HLJP和VC的IC50分別為44.28、65.09 mg·L-1。

圖3　HLJP對DPPH·的清除率Fig.3　Scavenging rate of HLJP on DPPH· free radicals

2.2.3HLJP對ABTS+·清除率的測定HLJP和VC對ABTS+·清除率見圖4。在5～65 mg·L-1的濃度范圍內(nèi),ABTS+·清除率隨著清除劑濃度的增加逐漸增強(qiáng),存在良好的量效關(guān)系。在濃度為65 mg·L-1時,HLJP和VC對ABTS+·清除率分別可達(dá)到100%、87.39%。比較相同濃度下的清除率可知,HLJP對ABTS+·清除能力強(qiáng)于VC。HLJP和VC的IC50分別為35.07、44.17 mg·L-1。

圖4　HLJP對ABTS+·清除作用Fig.4　Scavenging rate of HLJP on ABTS+· free radicals

3　結(jié)論

在植物有效成分的提取中,由于超聲波獨(dú)特的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng),越來越受到學(xué)者的重視。本文利用響應(yīng)面法對超聲輔助提取HLJP的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),影響提取得率的因素依次為:料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時間,優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)40.8%、提取時間4.8 min、料液比1∶60 g∶mL、提取溫度67.5 ℃。在此工藝條件下,HLJP的提取量為29.43 mg/g。HLJP對Fe3+的還原能力、清除DPPH·和ABTS+·的能力均強(qiáng)于VC,說明青莢葉多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力。因此,青莢葉可以作為抗氧化的功能性食品,有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。

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Study on the ultrasound-assisted extraction and antioxidant capacity of Polyphenols fromHelwingiaJaponica

SUN Zhi-wu1,LI Ning2,LI Hao1,LI Hong-ping2,*

(1.College of public health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China;2.School of Chemical Engineering and Energy,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

The research aimed to determine the optimal ultrasonic-assisted extraction process ofHelwingiajaponicahelwpolyphenols and its antioxidant activityinvitro. On the basis of design and analysis of single-factor experiments,through which the optimal ultrasonic power and the frequency of extraction were found to be 65 W and two times,the technological conditions of ultrasonic-assisted for theHelwingiajaponicapolyphenols were optimized by response surface methodology and the antioxidant activity ofHelwingiajaponicapolyphenols was also studied by DPPH· and ABTS+·. The result showed that the optimum extraction conditions ofHelwingiajaponicapolyphenols were the volume fraction of 40.8% ethanol,ultrasonic time 4.8 min,solid-liquid ratio 1∶60(g∶mL),extraction temperature 67.5 ℃. Under this condition,the yield of polyphenols obtained was 29.43 mg/g. The tests of antioxidant capacity showed thatHelwingiajaponicapolyphenols had strong deoxidizing ability,and the IC50of DPPH· and ABTS+· were 44.28 mg/L and 35.07 mg/L respectively. Therefore,Helwingiajaponicahas a good potential as a natural antioxidant used in food or medicine industries.

Helwingiajaponica;polyphenols;ultrasound-assisted;response surface methodology;antioxidant activity

2015-05-15

孫志武(1989-)，男，碩士，研究方向：公共衛(wèi)生，E-mail:sunzhiwuyf@163.com。

李紅萍(1967-)，女，博士，教授，研究方向：綠色化工，E-mail:lhpdgw@zzu.edu.cn。

河南省教育廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(13A330459)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)03-0261-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.046