外源過氧化氫酶對液態(tài)發(fā)酵紅茶色素的影響

鐘艷梅,鄭清梅,曾憲錄,鄧妙玲

(嘉應(yīng)學(xué)院,廣東梅州 514015)

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外源過氧化氫酶對液態(tài)發(fā)酵紅茶色素的影響

鐘艷梅,鄭清梅,曾憲錄,鄧妙玲

(嘉應(yīng)學(xué)院,廣東梅州 514015)

為得到優(yōu)質(zhì)速溶紅茶,本研究以低檔綠茶為原料,對其水提液添加外源過氧化氫酶(CAT)進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵酶促轉(zhuǎn)化成紅茶茶湯,探討液態(tài)發(fā)酵工藝對紅茶色素生成量的影響,結(jié)果表明:參照優(yōu)質(zhì)紅茶色素含量標(biāo)準(zhǔn),CAT酶促轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件為:加酶量0.25 U/mL,反應(yīng)溫度45 ℃,反應(yīng)時(shí)間2 h,pH6。CAT與多酚氧化酶(PPO)存在雙酶協(xié)同作用,綠茶水提液先用PPO處理后(酶添加量 0.05 U/mL,溫度40 ℃,pH5,時(shí)間1.5 h)再用CAT處理,合成紅茶色素的效果比單一酶源好。

速溶紅茶,過氧化氫酶,多酚氧化酶,液態(tài)發(fā)酵

多酚氧化酶(PolypHenol oxidase,PPO)和過氧化物酶(Hydrogen Peroxidase,POD)是自然界中廣泛存在的兩種氧化還原酶類,更是茶中重要酶類,在茶樹生理代謝或茶葉加工中對多酚類物質(zhì)的氧化變化、茶葉品質(zhì)的形成起著決定性的作用。現(xiàn)代制茶發(fā)酵理論認(rèn)為,紅茶發(fā)酵的實(shí)質(zhì)就是其中的酚類在PPO及POD這兩種主要酶的作用下,發(fā)生一系列的酶促氧化聚合、縮合以及一些由于濕熱作用而引起的非酶促氧化反應(yīng),從而生成紅茶特有的色、香、味[1]。

速溶紅茶因保持了茶葉原來的色、香、味,且同時(shí)具備營養(yǎng)、衛(wèi)生、方便等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者喜愛,已成為全球最受歡迎的飲品[2]。目前速溶紅茶多用成品紅茶作原料,也有用綠茶或其它茶作原料的,但需將茶提取液添加外源酶進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵酶促轉(zhuǎn)化,如日本利用低檔綠茶或陳綠茶加入外源PPO進(jìn)行發(fā)酵處理,可使綠茶轉(zhuǎn)變?yōu)榧t茶[3]。嚴(yán)鴻德[4]報(bào)道指出:鮮葉制成綠茶后,用沸水浸提得抽提液,加入茶樹新梢第二輪中提出的PPO,可制得速溶紅茶,成品有較好的香氣、滋味。POD在茶中的作用類似PPO,這種酶可從茶鮮葉中提取,與茶黃烷醇接觸后仍能保持它的活性[5]。有報(bào)道指出[6],茶葉內(nèi)源POD可促進(jìn)綠茶的轉(zhuǎn)化,用于綠茶直接制造速溶紅茶。添加H2O2在“發(fā)酵”過程中起氧化劑的作用,而茶葉POD則對茶黃烷醇的氧化起主要的催化作用[7]。葉慶余[8]則通過實(shí)驗(yàn)證明在紅茶發(fā)酵過程中,PPO和 POD能催化兒茶素迅速氧化聚合成茶黃素(TFs)、茶紅素(TRs)和高聚類物質(zhì)(如茶褐素TBs)。PPO催化能促使生成茶黃素和相對簡單的二聚體物質(zhì),而POD的催化底物較PPO廣泛,可催化茶黃素氧化形成不溶性的茶紅素復(fù)合物。由此認(rèn)為,發(fā)酵后期茶黃素形成速度低于分解速度,而茶紅素及更高聚的不溶物質(zhì)積累增快,可能與POD作用有關(guān)[9-10]。

有關(guān)研究表明,茶黃素是湯色“亮”的重要成分,茶紅素是湯色“紅”和滋味強(qiáng)度的主要物質(zhì),并與茶湯的濃度有關(guān);茶褐素是湯色“暗”的主要原因。當(dāng)茶褐素含量達(dá)6%～8%時(shí),湯色呈現(xiàn)紅褐明亮的品質(zhì)特征,而茶褐素含量低于5%時(shí),湯色則呈現(xiàn)紅橙明亮的特征,這在工藝上被認(rèn)為發(fā)酵不足。只有在茶紅素與茶黃素含量都較高且比例適當(dāng)時(shí),才能形成紅茶優(yōu)良的品質(zhì)[11-12]。

本研究以梅州當(dāng)?shù)氐牡蜋n綠茶為原料,添加POD中的過氧化氫酶(CAT)進(jìn)行酶促液態(tài)發(fā)酵,將低檔綠茶加工為速溶紅茶,同時(shí)研究了CAT與PPO的雙酶協(xié)同作用,為茶葉深加工提供一定理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

低檔綠茶梅州清涼山綠茶加工過程中的茶葉碎,含部分茶梗。

T6可見分光光度計(jì)上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;FB224電子分析天平上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;HH.SY11-N14數(shù)顯恒溫水浴鍋常州華冠儀器廠;L420臺式低速離心機(jī)濟(jì)南博華儀器設(shè)備有限公司;過氧化氫酶(CAT、50000 U/g)廣東盛生物科技有限公司;多酚氧化酶(PPO、100000 U/g、含量60%)河南萬達(dá)食品添加劑。

1.2液態(tài)發(fā)酵紅茶湯制備

1.2.1綠茶水提液制備將低檔綠茶粉碎過40目篩,茶水比1∶20(g/mL),超聲波輔助浸提20～30 min,浸提溫度60 ℃,冷卻后以3500 r/min 離心15 min得到綠茶水提液,用于液態(tài)酶促發(fā)酵。

1.2.2液態(tài)酶促轉(zhuǎn)化

1.2.2.1單因素實(shí)驗(yàn)酶轉(zhuǎn)化溫度：將綠茶水提液按0.15 U/mL的量添加外源CAT,設(shè)置不同溫度分別為15、25、35、45、55和65 ℃,在pH6條件下發(fā)酵2 h,轉(zhuǎn)化完成后將紅茶湯迅速冷卻至室溫并抽濾,進(jìn)行茶黃素、茶紅素和茶褐素測定,以紅茶色素含量為指標(biāo)篩選最佳轉(zhuǎn)化溫度。

酶轉(zhuǎn)化pH：酶源添加量同上,將綠茶水提液在35 ℃下發(fā)酵2 h,用檸檬酸-磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)pH分別為3、4、5、6、7、8,所得茶湯同上處理,選出最佳轉(zhuǎn)化pH。

酶添加量：將綠茶水提液分別按0.03、0.09、0.15、0.3、0.45、0.6 U/mL的量添加外源CAT酶,在35 ℃、pH7條件下發(fā)酵2 h,所得茶湯同上處理,篩選最佳用酶量。

酶反應(yīng)時(shí)間：將綠茶水提液按0.3 U/mL的量添加外源CAT,在35 ℃、pH7下發(fā)酵,設(shè)置不同反應(yīng)時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 和3 h,所得茶湯同上處理,確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.2.2正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇反應(yīng)體系4個(gè)主要因素(溫度、pH、酶添加量、時(shí)間),采用L16(44)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行4因素4水平的正交實(shí)驗(yàn),以確定CAT最佳反應(yīng)條件,正交因素水平如表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1　Orthogonal experimental design

1.2.2.3PPO和CAT雙酶轉(zhuǎn)化研究采用PPO、CAT雙酶源協(xié)同催化綠茶水提液,即先向反應(yīng)體系中加入PPO(先前實(shí)驗(yàn)獲得的最佳反應(yīng)條件為:酶添加量0.05 U/mL,溫度40 ℃,pH5,時(shí)間1.5 h),然后用CAT處理,最后沸水浴30 s終止反應(yīng),檢測紅茶色素含量。

1.3分析方法

茶黃素、茶紅素、茶褐素檢測方法,采用比色系統(tǒng)分析法[13]。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有的數(shù)據(jù)采用Excel2003和SPSS17軟件進(jìn)行分析,采用Duncan(p<0.05)法進(jìn)行多重比較,同一紅茶色素之間沒有共同字母的表示有顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1酶促轉(zhuǎn)化單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1最佳反應(yīng)溫度對綠茶水提液添加CAT進(jìn)行液態(tài)酶促發(fā)酵,考察不同反應(yīng)溫度對紅茶色素生成的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1　不同溫度對紅茶色素形成的影響Fig.1　The effect of different temperature on the synthetic tea pigment by using CAT

由圖1可知,CAT活力受溫度影響,不同溫度下,CAT催化形成紅茶色素的情況:35 ℃時(shí)與紅茶品質(zhì)正相關(guān)的茶黃素含量(1.23%)和茶紅素含量(7.08%)顯著高于其它溫度,而與紅茶品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)茶褐素含量(7.85%)顯著低于其它溫度,參考優(yōu)質(zhì)紅茶中紅茶色素含量及比例(茶黃素一般為0.3%～1.5%、茶紅素一般為5%～11%、茶褐素一般為4%～9%,茶黃素與茶紅素之比1∶10～12)[13-14],此時(shí)各紅茶色素含量雖然符合要求,但茶黃素與茶紅素之比約為1∶6,不符合標(biāo)準(zhǔn),而45 ℃時(shí)茶黃素含量(0.72%)、茶紅素含量(6.45%)及其比例(約為1∶9)以及茶褐素含量(7.59%)都比較符合標(biāo)準(zhǔn),綜合考慮取35～45 ℃為較佳反應(yīng)溫度范圍。

2.1.2最佳反應(yīng)pH不同反應(yīng)pH對速溶紅茶色素生成的影響,結(jié)果如圖2。

圖2　pH對紅茶色素形成的影響Fig.2　The effect of pH value on the synthetic tea pigment by using CAT

pH對兒茶素氧化產(chǎn)物形成的影響,首先是通過酶活力的作用,酶活力受環(huán)境pH的影響極大,過高或過低的pH會改變酶的性質(zhì),降低酶活力,從而使紅茶色素的形成量減少[15],由圖2可知不同pH條件下,CAT催化形成紅茶色素的情況。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,當(dāng)pH為7時(shí),茶黃素生成量(0.89%)和茶紅素生成量(11.45%)均顯著高于其它pH的,茶黃素與茶紅素比為1∶12.9,此時(shí)茶褐素生成量為7.19%,各紅茶色素比較符合優(yōu)質(zhì)紅茶標(biāo)準(zhǔn)。而當(dāng)pH為6時(shí),雖然三種紅茶色素分別符合優(yōu)質(zhì)紅茶標(biāo)準(zhǔn),但茶黃素與茶紅素比約為1∶18,茶紅素比例太高會使茶湯深暗,對紅茶品質(zhì)不利,故最佳反應(yīng)pH選擇7。

2.1.3最佳酶添加量不同酶添加量對速溶紅茶色素生成的影響,結(jié)果如圖3。

圖3　酶添加量對紅茶色素合成的影響Fig.3　The effect of enzyme concentration on the synthetic tea pigment by using CAT

由圖3可知,不同酶添加量條件下,CAT催化形成紅茶色素的情況:茶黃素生成量較高的酶添加量是0.3 U/mL(0.63%),顯著高于其它酶添加量;茶紅素生成量較高的酶添加量是0.3 U/mL(8.02%),此時(shí)兩者比例約為1∶12;在此酶添加量下,茶褐素生成量為8.81%,符合優(yōu)質(zhì)紅茶標(biāo)準(zhǔn),故最佳酶添加量選0.3 U/mL。

2.1.4最佳反應(yīng)時(shí)間不同反應(yīng)時(shí)間對速溶紅茶色素生成的影響,結(jié)果如圖4。

圖4　反應(yīng)時(shí)間對紅茶色素合成的影響Fig.4　The effect of reaction time on the synthetic tea pigment by using CAT

由圖4可知,不同反應(yīng)時(shí)間下各色素含量變化:當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.5 h時(shí),茶黃素生成量(0.85%)和茶紅素生成量(6.33%)顯著高于其它反應(yīng)時(shí)間(兩者比例1∶7.4)此時(shí)茶褐素生成量為8.79%,相比其它組比較符合優(yōu)質(zhì)紅茶色素含量標(biāo)準(zhǔn),故最佳反應(yīng)時(shí)間取2.5 h。

2.2反應(yīng)條件的正交優(yōu)化

表2、表4、表6分別為茶黃素、茶紅素和茶褐素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表3、表5、表7為正交實(shí)驗(yàn)的方差分析表。

表2　茶黃素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　The result of orthogonal experiment of TFs

CAT催化轉(zhuǎn)化茶黃素時(shí),根據(jù)表2極差分析結(jié)果,各因素對茶黃素含量的影響順序?yàn)锽>D>C>A;根據(jù)表3正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果,B因子具有顯著性(p<0.05)其他因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不明顯;最優(yōu)組合為A2B2C1D4。

表3　茶黃素正交實(shí)驗(yàn)的方差分析表Table 3　The table of variance analysis of orthogonal experiment of TFs

CAT催化轉(zhuǎn)化茶紅素時(shí),根據(jù)表4極差分析結(jié)果,各因素對茶紅素含量的影響順序?yàn)镈>B>C>A;根據(jù)表5正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果,D因子具有顯著性(p<0.05);最優(yōu)組合為A4B3C4D1。

表4　茶紅素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4　The result of orthogonal experiment of TRs

CAT催化轉(zhuǎn)化茶褐素時(shí),據(jù)表6極差分析結(jié)果,各因素對茶褐素含量的影響順序?yàn)镈>B>C>A;據(jù)表7正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果,各因子顯著性都不高;優(yōu)組合為A3B2C2D2。

表5　茶紅素正交實(shí)驗(yàn)的方差分析表Table 5　The table of variance analysis of orthogonal experiment of TRs

表6　茶褐素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6　The result of orthogonal experiment of TBs

表7　茶褐素正交實(shí)驗(yàn)的方差分析表Table 7　The table of variance analysis of orthogonal experiment of TBs

正交實(shí)驗(yàn)后的茶黃素、茶紅素、茶褐素含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過方差分析,單獨(dú)分析出的優(yōu)化條件不一致,則根據(jù)因素的影響主次等綜合考慮,確定最佳工藝條件。

對于因素A(反應(yīng)時(shí)間),其對茶黃素、茶紅素和茶褐素影響均為次要因素,比較之下A1的紅茶品質(zhì)較好,因此取A1(2 h);因素B(pH)對茶黃素影響排第一位,故取B2,其對茶紅素影響排第二位,取B3,而對茶褐素影響也排第二位,取B2,因此因素B取B2(6);因素C對茶紅素、茶黃素和茶褐素的影響都排第三位,分別取C1C4C2,三者相比取C4紅茶品質(zhì)較好,故因素C取C4(45 ℃);對于因素D,其對茶紅素的影響排第一位,此時(shí)取D1,其對茶黃素和茶褐素的影響排第二位,為較次要因素,故因素D取D1(0.25 U/mL)。綜合分析,最優(yōu)組合為A1B2C4D1,即加酶量為0.25 U/mL,反應(yīng)溫度為45 ℃,pH6,反應(yīng)時(shí)間2 h。

2.3雙酶催化轉(zhuǎn)化結(jié)果

結(jié)果如表8。

表8　單一酶源與雙酶源對合成紅茶色素的比較Table 8　The comparison between single enzyme and double enzyme on synthetic tea pigment

酶促氧化制備紅茶所采用的酶類主要是PPO和POD[16],其中PPO主要催化兒茶素生成茶黃素及相對簡單的二聚體,而POD不僅催化兒茶素生成茶黃素和二聚體,且能催化茶黃素生成茶紅素以及更復(fù)雜的高聚體TBs等,因此,在雙酶體系下酶促氧化可以進(jìn)行得更徹底。由表8可知,單一酶源酶促轉(zhuǎn)化時(shí),茶黃素和茶紅素的比例過小或過大;雙酶酶促轉(zhuǎn)化紅茶色素結(jié)果顯示:茶黃素含量略微超出標(biāo)準(zhǔn),但茶黃素與茶紅素的比例適當(dāng),而茶褐素的生成量減少,使紅茶茶湯有較好的品質(zhì)。

3　結(jié)論與討論

在紅茶液態(tài)發(fā)酵中,利用外源CAT可將綠茶水提液酶促轉(zhuǎn)化成紅茶茶湯,在一定條件下,其對紅茶色素的生成量有顯著影響,酶反應(yīng)最優(yōu)條件為:加酶量0.25 U/mL,反應(yīng)溫度45 ℃,反應(yīng)時(shí)間2 h,pH6。CAT與PPO存在雙酶協(xié)同作用,綠茶水提液先用PPO處理后(酶添加量0.05 U/mL,溫度40 ℃,pH5,時(shí)間1.5 h)再用CAT處理,生成紅茶色素的效果比單一酶源要好。

本實(shí)驗(yàn)不但探究出外源CAT催化轉(zhuǎn)化紅茶色素的最佳條件,還首次采用雙酶作用于速溶紅茶液態(tài)發(fā)酵,與單一酶源轉(zhuǎn)化法相比,該方法可使茶黃素的生成量提高而使茶褐素的生成量減少,使得紅茶茶湯有較好的品質(zhì)。先加入POD的作用主要是形成茶黃素,而酯型茶黃素(TFG和TFDG)中,TFG能被水解產(chǎn)生沒食子酸,且能導(dǎo)致苯丙卓酚酮環(huán)核的裂解作用而形成3,4-二羥苯甲酸、沒食子酸、咖啡酸和鄰苯二酚等一系列的裂解產(chǎn)物。Robertson研究認(rèn)為[20],酯型茶黃素(TFG和TFDG)被水解產(chǎn)生沒食子酸的過程與CAT無關(guān)。隨后加入的CAT可使TFG酶促氧化轉(zhuǎn)化為茶紅素,因此在雙酶體系下該酶促反應(yīng)可以進(jìn)行得更為徹底。

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Effect of exogenous catalase on the pigment composition of fermented instant black tea

ZHONG Yan-mei,ZHENG Qing-mei,ZENG Xian-lu,DENG Miao-ling

(School of Life Science,Jiaying University,Meizhou 514015,China)

Exogenous catalase was added in water extract solution of low-grade green tea to transform it into instant black tea by liquid state fermentation,the effects of enzyme types and addition rates on the pigment composition of black tea infusion were investigated;and fermentation technology was optimized by reference to standard of top quality black tea. Result showed that the optimized conditions were:catalase addition rate was 0.25 U/mL,fermentation temperature at 45 ℃,pH6,for 2 h. Pretreatment of the green tea extract with polyphenol oxidase(addition rate 0.05 U/mL,temperature 40 ℃,pH5,time 1.5 h)previous to the addition of catalase produced better pigment composition of black tea than addition of catalase along,indicating that synergetic action existed between the two enzymes.

instant tea;catalase;polyphenol oxidase;liquid-state fermentation

2015-04-23

鐘艷梅(1975-),女,碩士,講師,研究方向:食品資源研究開發(fā),E-mail:zym@jyu.edu.cn。

鄭清梅(1979-),女,博士,副教授,研究方向:食品生物化學(xué),E-mail:zhqm78@163.com。

廣東省自然科學(xué)基金(S2013010013693)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0256-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.045