木瓜蛋白酶酶解牦牛血紅蛋白制備氯化血紅素關鍵工藝研究

賈志春,張　珍,張盛貴,牛黎莉,趙圓圓,肖雪莉,徐榮榮,包雪梅

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

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木瓜蛋白酶酶解牦牛血紅蛋白制備氯化血紅素關鍵工藝研究

賈志春,張珍*,張盛貴,牛黎莉,趙圓圓,肖雪莉,徐榮榮,包雪梅

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

利用牦牛血中豐富的血紅蛋白來制備氯化血紅素。以新鮮牦牛血為原材料,通過預處理獲得血紅蛋白,之后進行酶解獲取氯化血紅素,在單因素實驗的基礎上,利用Box-Benhnken中心組合旋轉實驗和響應面分析法,確定了酶解血紅蛋白制備氯化血紅素的(酶解溫度、酶解時間、pH、酶添加量)最適工藝條件,結果表明,提取氯化血紅素的最佳工藝為:酶解溫度55 ℃、酶解時間94 min、pH8.0、酶添加量0.08 g。木瓜蛋白酶對酶解牦牛血紅蛋白制備氯化血紅素有實際意義,在此工藝條件下,氯化血紅素的濃度可達6.47 μg/mL。

牦牛血,木瓜蛋白酶,氯化血紅素,響應面法

牦牛血液中有豐富的蛋白質,蛋白含量在牦牛全血中為15.5%±0.8%,血漿中為6.9%±0.7%，血細胞中為32.7%±0.9%，是非常理想的蛋白質資源[1-2]。血紅素是具有卟啉結構的分子,四個吡咯環上的氮原子與一個亞鐵離子配位卟啉分子中心結合,一般生命體內每100 mL血液中鐵的含量可達40 mg,是肌肉肌紅蛋白中鐵含量的10～80倍[3]。血紅素主要存在于動物的血液和肌肉中，是動物血液中的天然色素,具有重要的生理功能和很高的實用價值,廣泛應用于醫藥、食品、化工、保健品、建筑及化妝品行業[4-7]。

酶法制備血紅素鐵由于不用其他有機試劑,是目前最環保的方法,吳寶承[8]等分別選取胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶酶解血紅蛋白,結果顯示中性效果最好。張亞娟[9]等采用預處理的血紅蛋白粉為原料分別用單一酶和復合酶酶解血紅蛋白。采用生物酶水解血紅蛋白制取富含血紅素的生物活性肽,可以有效預防缺鐵性貧血,但大多都是鹿血[10]、牛血[11]、豬血[12]血紅素提取研究,中國是牦牛的發源地之一,也是當前世界上飼養牦牛數量最多的國家,全國牦牛的存欄總數大約有1400多萬頭,大約占我國飼養牛[13]總數的16.67%。傳統方法提取的血紅素,有特殊的味道且有溶劑殘留,影響血紅素有效利用。本實驗利用木瓜蛋白酶將牦牛血紅蛋白水解制備氯化血紅素,獲得純天然無污染小分子純度高易被人體吸收利用的血紅素,探索酶解優化條件以期為牦牛血紅素的開發利用提供理論研究基礎和技術支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮牦牛血甘肅甘南瑪曲屠宰廠;血紅素標準品(純度98%)美國sigma公司;木瓜蛋白酶(酶活80萬U/g)上海源葉生物科技公司;檸檬酸、甲醛、鹽酸、濃硫酸、甲醛、硫酸銅、溴甲酚綠、甲基藍、無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、硼酸(國產分析純)。

H-1850R低溫離心機;HHS型電熱恒溫水浴鍋;CJJ78-1磁力加熱攪拌器;雷磁pHS-3C酸度計;DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器;電子天平;JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機;K9840自動凱氏定氮儀;T6新世紀紫外可見分光光度計;BPZ-6063真空干燥箱。

1.2實驗方法

1.2.1工藝流程新鮮牦牛血→抗凝處理(5000 r/min)→沉淀紅細胞→生理鹽水洗滌→離心分離→濃縮紅細胞→超聲波破胞處理→加酶→調節pH→在不同酶解條件下(酶解時間、酶解溫度、pH、酶添加量)酶解處理→滅酶→冷卻離心→牦牛血紅素

1.2.2牦牛血細胞的預處理取一定體積的牦牛血抗凝處理后,以5000 r/min離心15 min,傾出上清液,收集紅細胞。取上述紅細胞150 mL用等體積(生理鹽水)洗滌紅細胞,離心,重復2次。加入(1 mol/L的氯化鈉和10 mL無水乙醇)攪拌混勻,超聲波細胞粉碎機(功率為0.8 kW,處理10 min)參照趙劍龍[14]的方法略有改進。獲得細胞破碎液密封冷藏于4 ℃冰箱。

1.2.3酶水解取上述樣液加入600 mL蒸餾水參照楊錫洪[15]的方法略有改進,攪拌混勻,加入木瓜蛋白酶與一定量的還原劑半胱氨酸[16],用0.1 mol/L檸檬酸調節pH放入水浴鍋啟動反應。水解過程中滴加0.1 mol/L的NaOH保持pH恒定。反應結束后,沸水浴15 min滅酶冷卻離心獲得上清液測定血紅蛋白水解度,沉淀用于氯化血紅素濃度計算。

1.3測定方法

1.3.1水解度的測定水解度(DH)測定方法根據公式

式中:TN-(Total Nitrogen):總氮量,用微量凱氏定氮法測定[17];AN-(Amino Nitrogen):氨基態氮的含量,甲醛電位滴定法測定[18]。

1.3.2氯化血紅素含量的測定采用分光光度法[6]。

1.4酶解工藝單因素實驗

1.4.1酶解溫度的選擇將0.08 g的木瓜蛋白酶加入破胞處理后的細胞液中,采用0.1 mol/L的檸檬酸將pH調節到7.0,分別在溫度40、45、50、55、60 ℃下酶解100 min,90 ℃條件下滅酶15 min,冷卻后,離心測定上清液的血紅蛋白水解度以及沉淀中的氯化血紅素濃度。

1.4.2酶解時間的選擇將0.08 g的木瓜蛋白酶加入破胞處理后的細胞液中,采用0.1 mol/L的檸檬酸將pH調節到7.0,分別在50 ℃下酶解50、100、150、200、250 min,90 ℃條件下滅酶15 min,冷卻后,離心測定上清液的血紅蛋白水解度以及沉淀中的氯化血紅素濃度。

1.4.3酶解pH的選擇將0.08 g的木瓜蛋白酶加入破胞處理后的細胞液中,采用0.1 mol/L的檸檬酸將pH調節到7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,在50 ℃下,水解100 min,90 ℃條件下滅酶15 min,冷卻后,離心測定上清液的血紅蛋白水解度以及沉淀中的氯化血紅素濃度。

1.4.4酶添加量的選擇將0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g的木瓜蛋白酶加入破胞處理后的細胞液中,采用0.1 mol/L的檸檬酸將pH調節到7.0,在50 ℃下,水解100 min,90 ℃條件下滅酶15 min,冷卻后,離心測定上清液的血紅蛋白水解度以及沉淀中的氯化血紅素濃度。

1.5響應面實驗

在單因素實驗基礎上,以木瓜蛋白酶的酶解溫度、酶解時間、酶解pH、酶添加量作為響應子,氯化血紅素的濃度為響應值,進行Box-Behnken的中心組合實驗設計,響應面實驗設計見表1。

表1　響應面實驗因素及編碼水平Table 1　Encode table of factors and levels

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果與分析

2.1.1溫度對酶解反應的影響由圖1分析可知,在一定溫度范圍內40～50 ℃,酶解效果與溫度成正相關。隨著酶解溫度的升高,氯化血紅素濃度與水解度都增大,當溫度為50 ℃時,氯化血紅素濃度達到8.24 μg/mL,水解度為13.4%,氯化血紅素濃度與水解度都達到了最高,溫度繼續提高時氯化血紅素濃度基本不變,血紅蛋白水解度有所下降,當溫度為55 ℃和60 ℃時,氯化血紅素濃度比50 ℃時下降了3%和4%。由于牦牛血中紅細胞破胞后血紅蛋白有凝固的趨勢不利于后續實驗的進行,同時在酶解過程中,適當的提高溫度可增加酶的活力[19],促進水解,若溫度過高,使血紅蛋白和酶變性則對水解不利,因此選擇50 ℃為木瓜蛋白酶適宜的酶解溫度。

圖1　溫度對酶解過程的影響Fig.1　Effect of temperature on the enzymatic hydrolysis process注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖2～圖4同。

2.1.2pH對酶解反應的影響由圖2得出血紅蛋白經過不同初始的pH處理后,對氯化血紅素濃度和血紅蛋白的水解度有較大的影響,隨著pH升高氯化血紅素濃度和血紅蛋白的水解度先增大后減小,在pH8.0時氯化血紅素濃度達到4.83 μg/mL,水解度也達到最大,并與其他水平有顯著性差異(p<0.05),當pH為8.5和pH9.0時氯化血紅素濃度比pH8.0時下降了8%和6%。由于pH作為變性因素的存在,使血紅素上的丙酸基與珠蛋白結合的兩個化學鍵及血紅素中的鐵與珠蛋白組氨酸咪唑環的氮形成的兩個配位鍵斷裂[20-22],從而使血紅蛋白中的血紅素與珠蛋白分離達到水解目的,不同的pH處理會對底物和酶的構象造成較大影響,pH應該控制在反應最適范圍內有利于酶活力的充分發揮,因此pH在8.0是較優選擇。

圖2　pH對酶解過程的影響Fig.2　Effect of pH on the enzymatic hydrolysis process

2.1.3時間對酶解反應的影響從圖3可以看出氯化血紅素濃度、血紅蛋白水解度在實驗范圍內隨著時間的延長,氯化血紅素濃度、血紅蛋白水解度先增大,在100 min時氯化血紅素濃度達到5.97 μg/mL并與其他水平有顯著性差異(p<0.05),血紅素濃度、水解度變小,當酶解時間為150、200、250 min時,氯化血紅素濃度比時間為100 min時下降了2%、4%和6%。酶解時間的長短會直接影響整個反應,水解時間過短導致反應不充分,不能完全水解血紅蛋白釋放出血紅素,水解時間過長時作用底物被消耗水解度隨之下降,由于水解產物被氧化以及在體系達到溶解平衡,致使血紅素濃度和水解度反而減小[23],從原料利用和水解產物等方面考慮酶解時間取100 min為宜。

圖3　時間對酶解過程的影響Fig.3　Effect of time on the enzymatic hydrolysis process

2.1.4酶添加量對酶解反應的影響從圖4可以看出,隨著酶量增加,氯化血紅素的濃度與血紅蛋白的水解度量逐漸上升,加酶量0.10 g時血紅蛋白的水解度最大。當酶添加量為0.12、0.14 g時氯化血紅素濃度相比0.10 g時降低了2%、3%,之后氯化血紅素濃度基本不變,水解度緩慢減少,說明底物已經基本被酶飽和了,再增加酶量對反應的貢獻不大,因此選擇酶添加量0.10 g為較優值。

圖4　酶添加量對酶解過程的影響Fig.4　Effect of add the amount of enzyme on the enzymatic hydrolysis process

2.2響應面法確定木瓜蛋白酶水解血紅蛋白的最佳工藝

根據Box-Behnken的統計設計原理,參考單因素實驗結果,采用響應面分析法對木瓜蛋白酶水解牦牛血紅蛋白的工藝進行分析和優化,實驗結果如表2所示。

血紅素濃度(μg/mL),進行回歸分析得到關于酶解時間、溫度、pH、酶添加量的四個因素的擬合二次項多項式方程:

Y=6.51-0.23A-0.12B-0.33C-0.042D-0.040AB-0.11AC+0.032AD+8.419E-003BC-0.068BD-0.054CD-0.42A2-0.45B2-0.66C2-0.57D2

2.2.1牦牛氯化血紅素濃度的響應面分析圖5顯示了當酶解溫度與酶添加量為中心水平時,酶解時間與pH對氯化血紅素濃度的交互作用。酶解時間一定時,氯化血紅素濃度隨著pH呈現先增大后減小的趨勢;當pH不變時,氯化血紅素濃度隨著pH也呈現先增大后減小的趨勢;酶解時間和pH在95～105 min、7.9～8.3之間時,氯化血紅素濃度有最大值。

表2　響應面分析方案及實驗結果Table 2　Test design and results of response surface analysis

圖5　酶解時間、pH對氯化血紅素濃度的度的響應面圖Fig.5　Hydrolysis time and pH on the hemin concentration response surface

圖6顯示了當酶解時間與pH為中心水平時,酶解溫度與酶添加量對氯化血紅素濃度的交互作用。酶解溫度一定時,氯化血紅素濃度隨著酶添加量呈現先增大后減小的趨勢;當酶添加量不變時,氯化血紅素濃度隨著酶解溫度也呈現先增大后減小的趨勢;酶解溫度和酶添加量在52～56 ℃、0.07～0.09 g之間時,氯化血紅素濃度有最大值。

圖6　酶解溫度、酶添加量 對氯化血紅素濃度的響應面圖Fig.6　Hydrolysis temperature and the amount of enzyme on the hemin of enzyme on the hemin concentration response surface

圖7顯示了當酶解時間與酶解溫度為中心水平時,pH與酶添加量對氯化血紅素濃度的交互作用。pH一定時,氯化血紅素濃度隨著酶添加量呈現先增大后減小的趨勢;當酶添加量不變時,氯化血紅素濃度隨著pH也呈現先增大后減小的趨勢;pH和酶添加量在7.7～8.1、0.07～0.09 g之間時,氯化血紅素濃度有最大值。

圖7　pH、酶添加量對氯化血紅素濃度的響應面圖Fig.7　Hydrolysis amount of enzyme and pH on the hemin concentration response surface

表3　響應面模型的方差分析Table 3　Variance analysis of response surface model

注:p<0.01 極顯著(**);p<0.05 顯著(*);p>0.05 不顯著(-)。

2.3驗證性實驗

對氯化血紅素濃度取最大值,由軟件自動分析可得到氯化血紅素提取工藝最佳理論值:酶解溫度54.49 ℃、酶解時間93.80 min、pH7.89、酶添加量0.08 g,血紅素濃度6.59 μg/mL。考慮實際操作方便,選取酶解溫度55 ℃,酶解時間94 min,pH8.0,進行3次平行實驗,最終氯化血紅素濃度為6.47 μg/mL,與理論值較為接近,說明該數學模型的建立對牦牛血氯化血紅素的獲取具有可行性。

3　結論

通過單因素(酶解溫度、酶解時間、pH、酶添加量)四水平為實驗因素,分別以氯化血紅素濃度與血紅蛋白水解度為考察指標,利用響應面軟件對氯化血紅素含量為響應值進行模型建立和模型預測,得出牦牛血中氯化血紅素最佳提取工藝條件分別為:酶解溫度55 ℃、酶解時間94 min、pH8.0、酶添加量0.08 g。在此工藝條件下,水解度為11.8%,氯化血紅素的濃度可達6.47 μg/mL,相比理論值減少了1.7%。說明該數學模型對優化牦牛血中氯化血紅素提取工藝可行,并為綜合利用牦牛血資源提供了理論依據。

利用木瓜蛋白酶酶解牦牛血紅蛋白制備氯化血紅素相對于有機溶劑法是一種綠色環保的方法,制備過程制備時間短、制備效率高、制備效果好,且獲得的氯化血紅素后期純化過程簡單殘留少,在牦牛血液資源開發方面有較大的空間,其具體的應用以及后期的開發還需要進一步深入探討。

[1]于海燕,羅永康.對牦牛血理化性質的研究[J]. 肉類研究,2007(6):33-36.

[2]朱森陽,汪國和. 王志鵬. 畜禽血液資源的開發和利用進展[J]. 飼料與營養,2007(1):67-68.

[3]汪豐云. 血液中的科學[J]. 畜牧獸醫,2006(12):59-63.

[4]袁曦,洪清,呂方生,等. 氯化血紅素膠囊的研制及臨床療效[J]. 中國藥房,1996,7(1):17-18.

[5]宋照軍,張延生,劉璽,等. 豬血中血紅素提取純化新技術研究[J]. 肉類工業,2004,(8):23-25.

[6]王君,康平利. 超聲波法提取氯化血紅素的研究[J]. 藥物生物技術，2004,11(4):260-263.

[7]In Man Jin,Hee J eong Chae,Oh NamSoon. Process development for heme enriched peptide by enzymatic hydrolysis of hemo globin[J]. Bioresource Technology,2002,84(1):63-68.

[8]吳保承,沈國強. 酶法提取豬血中血紅素的工藝研究[J]. 化學與生物工程,2009,(26):61-63.

[9]張亞娟.從豬血中酶法制取血紅素的研究[D]. 無錫：江南大學,2007.

[10]姜紅,施用暉. 木瓜蛋白酶水解馬鹿茸血制備免疫活性肽的研究[J]. 氨基酸和生物資源,2008,30(1):72-76.

[11]孫海梅. 我國加入WTO后青海牦牛業發展對策[J]. 畜牧與獸醫,2002,(34):8-12.

[12]吳保承,沈國強. 酶法提取豬血中血紅素的工藝研究[J].化學與生物工程,2009,(26):61-63.

[13]張玉斌,郭兆斌. 牛血資源綜合開發利用研究進展[J]. 肉類研究,2011,(25):30-34.

[14]趙劍龍. 響應面法優化馬血中氯化血紅素提取工藝的研究[J]. 加工與研究,2013,13(5):38-42.

[15]楊錫洪,夏文水. 酶法水解血紅蛋白制備亞鐵血紅素肽[J]. 食品與機械,2005,21(3):l4-l6.

[16]仇凱,陳志南. 木瓜蛋白酶制備抗人肝癌單抗F(ab')2及Fab片段[J]. 第四軍醫大學學報,1995,16(6):414-417.

[17]大連輕工業學院. 食品分析[M].北京:中國輕工業出版社,1995:221-223.

[18]王光亞. 保健食品功效成分檢測方法[M]. 北京:中國輕工業出版社,2002.

[19]張亞娟.從豬血中酶法制取血紅素的研究[D]. 無錫：江南大學,2007,(16):46-49.

[20]Branen A L，Davidson P M，Salminen S,et al.Antioxidants in:Food additives.Marcel.Dekker.Inc.1990,pp,139-193.

[21]葉林奇.組氨酸在蛋白質結構功能中的作用[J].涪陵師專學報,2000,16(4):21-24.

[22]Fiedler T J,Davey C A,Fenna R E. X-ray crystal structure and characterization of halide-binding sites of human myeloperxidase at 1.8 angstrom resolution[J].J Biol Chem.2000,(275):11964-11971.

[23]趙劍龍. 響應面法優化馬血中氯化血紅素提取工藝的研究[J]. 加工與研究,2013,13(5):38-42.

Study on the preparation technology of hemin from enzymolysis yak blood by papain

JIA Zhi-chun,ZHANG Zhen*,ZHANG Sheng-gui,NIU Li-li,ZHAO Yuan-yuan,XIAO Xue-li,XU Rong-rong,BAO Xue-mei

(College of Food Science and Technology,Gansu Agriculture University,Lanzhou 730070,China)

Preparation hemin with high content hemoglobin in yak blood. With fresh yak blood as the material to get the hemoglobin through pre-treatment,then through enzymolysis to get the hemin. On the basement of single factor test,using combination Box-Benhnken center rotation experiment and response surface analysis,the best extraction process of hemin from hemoglobin by enzymolysis as follows:55 ℃ for enzymolysis temperature,94 min and pH8.0 for enzymolysis,enzyme concentration was 0.08 g. After optimization,the yield of hemin reached 6.47 μg/mL. The enzymolysis yak blood by papain extract hemin is a useful method.

yak blood;papain;hemin;response surface analysis

2015-07-13

賈志春(1990-)，男，碩士，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail: 18894049864@163.com。

張珍(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科學，E-mail：zhangzhen@gsau.edu.cn。

甘肅省財政廳高校基本業務項目(1011JKCA179)；甘肅省農牧廳生物技術專項(GNSW-2013-22)；甘肅農業大學導師基金項目；甘肅省自然基金(1107RGZA23)。

TS251.1

B

1002-0306(2016)03-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.035