新疆野生櫻桃李枝、葉不同萃取部位抗氧化活性研究

劉　偉,李紫薇,陳文強(qiáng),朱　燕,歐陽(yáng)艷

(伊犁師范學(xué)院 新疆維吾爾自治區(qū)普通高校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn),新疆伊寧 835000)

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新疆野生櫻桃李枝、葉不同萃取部位抗氧化活性研究

劉偉,李紫薇,陳文強(qiáng),朱燕,歐陽(yáng)艷*

(伊犁師范學(xué)院 新疆維吾爾自治區(qū)普通高校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn),新疆伊寧 835000)

采用系統(tǒng)溶劑萃取野生櫻桃李枝、葉甲醇提取物,分別得到其石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相,采用分光光度法測(cè)定其總酚含量,并通過(guò)清除DPPH自由基能力、還原能力、總抗氧化能力等化學(xué)模型對(duì)各部位的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,野生櫻桃李枝、葉提取物抗氧化活性與其總酚含量呈正相關(guān)性,提示酚類(lèi)化合物為影響其抗氧化活性的主要因素。在三種抗氧化模型下,枝、葉各萃取相均表現(xiàn)一定的抗氧化活性,且具有相似的抗氧化活性規(guī)律:乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相,說(shuō)明乙酸乙酯和正丁醇可以有效地富集野生櫻桃李枝、葉抗氧化成分,其中樹(shù)枝乙酸乙酯相抗氧化活性著高于BHA。說(shuō)明野生櫻桃李枝、葉提取物具有作為天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

野生櫻桃李，抗氧化活性，總酚，高效液相色譜

野生櫻桃李(PrunusdivaricataLdb.),俗稱(chēng)野酸梅,薔薇科李屬,落枝灌木或小喬木[1]。植株高1.5～8.0 m,多分枝,枝條細(xì)長(zhǎng),開(kāi)展形,枝繁茂,深綠色[2],主要分布于中亞天山、高加索、小亞細(xì)亞及巴爾干半島,在我國(guó)僅分布于新疆伊犁霍城縣的大西溝和小西溝[3]。本地哈薩克牧民長(zhǎng)期食用櫻桃李果醬或?qū)⒐麑?shí)曬干泡茶飲用,被譽(yù)為“雪域珍果”[4],具有天然的保健功能和開(kāi)發(fā)前景。大量研究表明,具有抗氧化活性的物質(zhì)可以有效的降低心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生概率,并可以有效的延緩衰老[5-6]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)野生櫻桃李的研究多集中在生態(tài)、栽培及果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分等方面[7-8]。對(duì)其有效成分的提取與活性研究近年來(lái)才逐步開(kāi)展,其中野生櫻桃李果皮色素和果肉總酚提取物均表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性[9-10],對(duì)于野生櫻桃李枝、葉提取物抗氧化活性的研究鮮有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)采用系統(tǒng)溶劑法分別萃取野生櫻桃李枝、葉的甲醇提取物,得到相應(yīng)的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取相,采用分光光度法測(cè)定各萃取相中總酚的含量,通過(guò)清除DPPH自由基能力、還原能力、總抗氧化能力等化學(xué)模型對(duì)各部位的抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià),分析其總酚含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性,并對(duì)活性較好的部位進(jìn)行HPLC分析,為該植物的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野生櫻桃李枝、葉于新疆伊犁霍城縣大西溝10月采摘,經(jīng)伊犁師范學(xué)院資源與生態(tài)研究所趙玉副教授鑒定為薔薇科野生櫻桃李枝與葉,洗凈后自然晾干、粉碎過(guò)60目篩備用。

1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)長(zhǎng)城生物化學(xué)工程有限公司;VC、BHA、福林酚試劑Sigma公司;沒(méi)食子酸中國(guó)藥品生物制品檢定所;山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品分析標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鋁、三氯乙酸、氯化鐵、濃硫酸、鉬酸銨、磷酸鈉等均為分析純。

LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司;UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津分析儀器廠;FA2104電子天平上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;DD-5M型低速離心機(jī)湘儀離心機(jī)有限公司;SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵上海亞榮生化儀器廠;BAO-150AG型電熱恒溫干燥箱上海亞榮生化儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1野生櫻桃李枝、葉不同萃取部位提取工藝參照翁文江等方法[11],分別稱(chēng)取備用野生櫻桃李枝(2.0 kg)與葉(1.0 kg),以甲醇室溫下浸提3次(每次7 d),合并濾液減壓濃縮得樹(shù)枝總浸膏176 g,樹(shù)葉總浸膏193 g。分別將浸膏懸浮于300 mL蒸餾水中,加入等量的石油醚,搖勻3 min,放氣后靜置1 h,收集上層石油醚萃取物。下層水相同法萃取2次,合并萃取液,剩余水相按照上述方法依次用等量的乙酸乙酯、正丁醇萃取。將所得濾液濃縮、冷凍干燥至恒重,得樹(shù)枝石油醚萃取物(PBPE,7.73 g)、樹(shù)枝乙酸乙酯萃取物(PBEA,9.88 g)、樹(shù)枝正丁醇萃取物(PBBU,8.27 g);樹(shù)葉石油醚萃取物(PLPE,8.36 g)、樹(shù)葉乙酸乙酯萃取物(PLEA,5.52 g)、樹(shù)葉正丁醇萃取物(PLBU,3.45 g),保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2總酚含量的測(cè)定參照張毛莉等方法[12]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取不同濃度的各萃取相溶液1 mL于25 mL比色管中,加入1.0 mL福林酚試劑,搖勻靜置4 min,加入2 mL 7.5 g/L碳酸鈉溶液,蒸餾水定容。將上述溶液避光室溫放置2 h,以蒸餾水為空白參比,在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。取吸光度在線性范圍內(nèi)的數(shù)據(jù),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定各組分的總酚含量(以沒(méi)食子酸計(jì))。

1.2.3清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)參照陳乃東等方法[13]并稍加修改:分別量取系列濃度(0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL)的各萃取物、VC與BHA 0.5 mL于10 mL比色皿中,分別加入0.5 mL濃度0.6 mmol/L的DPPH乙醇溶液,將混合液用乙醇定容到5 mL,取0.5 mL DPPH緩沖液用乙醇定容到5 mL做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。室溫下避光放置30 min,以乙醇溶液做空白實(shí)驗(yàn),測(cè)定混合物在517 nm處的吸光度,每組樣品進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。DPPH自由基清除率按如下公式計(jì)算:

式中:A1為DPPH緩沖液的吸光度,A2為加入受試樣品后DPPH混合液的吸光度。

1.2.4還原能力測(cè)定參照文獻(xiàn)方法[14]并稍加修改:分別量取系列濃度(0.05,0.1,0.15,0.2,0.25 mg/mL)的各萃取物、BHA 2.5 mL于10 mL比色皿中,分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL鐵氰化鉀(1%)。將混合物放置到50 ℃的水浴中保溫20 min后,加2.5 mL三氯乙酸,3000 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液分別加入2.0 mL蒸餾水和0.5 mL氯化鐵溶液(0.1%),以乙醇溶液做空白實(shí)驗(yàn),測(cè)定混合物在700 nm處的吸光度,每組樣品進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5總抗氧化能力的測(cè)定參照周壽然等方法[15]并稍加修改:分別量取系列濃度(0.15,0.2,0.25,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL)的各萃取物、BHA 0.5 mL于10 mL比色皿中,加入4.5 mL磷鉬酸緩沖溶液,取0.5 mL乙醇和4.5 mL試劑溶液做空白對(duì)照,混勻后在95 ℃水浴中保溫1.5 h,在695 nm處測(cè)定吸光度,每組樣品進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.6PLEA水解條件參考張英等[16]方法,將10 mg的PLEA溶于10 mL甲醇,加入2 mL 4 moL/mL的鹽酸水溶液,70 ℃水浴下低速攪拌1.5 h,停止反應(yīng)。

1.2.7色譜條件InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫25 ℃;流動(dòng)相水(A)-甲醇(B)梯度洗脫(0～10 min,40%～45% B,10～30 min,45%～80% B,30～50 min,80%～60% B),流速0.8 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,進(jìn)樣量20 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1野生櫻桃李枝、葉各萃取相的總酚含量

按照1.2.2的方法,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=0.01272+0.01069X(R2=0.9990),表明樣品檢測(cè)濃度在19.75～69.25 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算野生櫻桃李枝、葉各萃取相的總酚含量列于表1。

由表1可知,各萃取相均含有酚類(lèi)物質(zhì),其中野生櫻桃李枝與葉的乙酸乙酯萃取物中總酚含量最高,分別為(263.76±3.08) mg/g和(220.48±4.86) mg/g,正丁醇相次之,提示野生櫻桃李枝與葉萃取物中富含中等極性酚類(lèi)物質(zhì)。石油醚萃取物中總酚含量較少,各萃取相總酚含量存在顯著性差異。

2.2野生櫻桃李枝、葉各萃取相抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1　野生櫻桃李枝、葉各萃取相的總酚含量Table 1　Contents of total phenols in the extracts from Prunus divaricata Ldb Branches and Leaves

注:同行字母不同表示數(shù)據(jù)存在差異(p<0.05)。

2.2.1清除DPPH自由基活性在多種快速評(píng)估抗氧化活性的方法中,清除DPPH自由基模型與其它方法相比更為廣泛使用。由圖1可知,在測(cè)定濃度范圍內(nèi),各受試樣清除DPPH自由基活性差異顯著。當(dāng)供試質(zhì)量濃度小于0.6 mg/mL時(shí),各萃取相活性與濃度量效關(guān)系明顯,其中活性較好的萃取相為PBEA、PBBU、PLEA。在質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí),三者對(duì)DPPH清除率分別為91.9%、90.7%、82.1%,遠(yuǎn)高于BHA活性(34.7%),與VC活性(96.2%)接近,此后三者活性呈濃度飽和型特征。其余萃取相在測(cè)試濃度內(nèi),呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。在同等供測(cè)質(zhì)量濃度下,PLBU活性較BHA活性好,PBPE活性與BHA活性相近,PLPE活性最差,在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)最高清除率僅為33.5%。

圖1　待測(cè)物清除DPPH活性Fig.1　DPPH scavenging activity of the test compounds

2.2.2還原能力大多數(shù)化合物的還原能力可以看作是其潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)。由圖2可知,在測(cè)定濃度范圍內(nèi),PBEA和PBBU表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力,顯著高于其它萃取物與BHA。PLEA和PLBU表現(xiàn)出與BHA相近的還原能力,且還原能力隨著濃度的增大而不斷增大,量效關(guān)系較為明顯。樹(shù)枝與樹(shù)葉石油醚相還原能力較差,推測(cè)其含有的酚類(lèi)化合物極性較小,還原能力較弱;乙酸乙酯相與正丁醇相含有中等極性的酚類(lèi)化合物,具有較好的還原能力。

圖2　待測(cè)物的還原能力Fig.2　 Reducing power of the test compounds

2.2.3總抗氧化活性由圖3可知,各萃取相之間總抗氧化活性差異顯著。在測(cè)定質(zhì)量濃度下,PLPE總抗氧化活性最差,PLBU、PBPE與BHA總抗氧化活性相近;其余萃取相總抗氧化活性均高于BHA,強(qiáng)弱順序?yàn)镻BBU

圖3　待測(cè)物的總抗氧化能力Fig.3　Total antioxidant capacity of the test compounds

2.3野生櫻桃李枝、葉各萃取相總酚含量與抗氧化相關(guān)性分析

有研究表明,櫻桃李等核果中的抗氧化活性與總酚含量緊密相關(guān)[10]。本研究參考邱高翔等[17]方法,考察了不同萃取相的抗氧化活性與其所含總酚的相關(guān)性。野生櫻桃李枝、葉各萃取相總酚含量與DPPH自由基清除活性、總抗氧化活性之間存在顯著的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)均大于0.9,說(shuō)明總酚為野生櫻桃李枝、葉抗氧化作用的主要活性成分,且總酚含量越高其活性越好。野生櫻桃李枝、葉各萃取相總酚含量與還原能力之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.783和0.705,推測(cè)是各萃取相酚類(lèi)化合物構(gòu)成差異大,導(dǎo)致總酚含量與還原能力相關(guān)性不顯著。

2.4野生櫻桃李枝、葉乙酸乙酯相化學(xué)成分HPLC初步分析

基于活性實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果,實(shí)驗(yàn)選取活性較優(yōu)的PBEA與PLEA為研究對(duì)象,利用HPLC-DAD法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了初步的分析,結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4　PBEA(A)和PLEA(B)的HPLC譜圖Fig.4　HPLC spectrum of PBEA(A)and PLEA(B)

圖5　乙酸乙酯萃取物典型紫外吸收譜圖Fig.5　The typical UV spectrum of ethyl acetate extract

在相同的HPLC色譜條件下,由圖4可知樹(shù)枝與樹(shù)葉乙酸乙酯萃取物化學(xué)成分構(gòu)成差異顯著,PBEA極性相對(duì)較大,圖4A中峰1～峰6紫外吸收譜圖相似,表現(xiàn)為圖5所示紫外譜圖,最大吸收峰出現(xiàn)在230 nm與280 nm附近,推測(cè)為一類(lèi)物質(zhì)。圖4A中峰7與圖4B峰1～峰5紫外吸收譜圖相似,表現(xiàn)為圖5所示紫外譜圖,最大吸收峰出現(xiàn)在265 nm與347 nm附近,為山奈酚糖苷類(lèi)化合物的典型紫外吸收波長(zhǎng)[18-19]。按照1.2.6實(shí)驗(yàn)方法將PLEA水解產(chǎn)物與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)TLC和HPLC比對(duì),證實(shí)PLEA水解產(chǎn)物以山奈酚為主要成分。各萃取相成分分析還需進(jìn)一步分離純化與鑒定。

3　結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明野生櫻桃李枝、葉提取物均具有一定的抗氧化活性,且呈濃度依賴(lài)性。枝、葉各萃取相抗氧化活性呈現(xiàn)相似的規(guī)律:乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相,說(shuō)明乙酸乙酯和正丁醇可以有效地富集野生櫻桃李枝、葉抗氧化成分。不同萃取相的DPPH自由基清除活性、總抗氧化活性與其所含總酚量呈顯著相關(guān)性,但還原能力與總酚含量相關(guān)系數(shù)小于0.9,推測(cè)不同萃取相酚類(lèi)化合物構(gòu)成差異較大,結(jié)構(gòu)存在差異的物質(zhì)對(duì)不同體系的抗氧化作用可能不同。樹(shù)枝各萃取相抗氧化活性較相應(yīng)的葉萃取相高,其中樹(shù)枝乙酸乙酯相抗氧化活性最好,顯著高于BHA。經(jīng)HPLC初步分析,樹(shù)枝與樹(shù)葉乙酸乙酯萃取物化學(xué)成分構(gòu)成差異顯著,且各自所含化合物的極性相近,因此分離純化過(guò)程會(huì)相對(duì)復(fù)雜。關(guān)于野生櫻桃李枝、葉提取物成分分離純化、活性構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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Study on antioxidant activity of different parts partitioned fromPrunusdivaricataLdb branches and leaves in Xinjiang

LIU Wei,LI Zi-wei,CHEN Wen-qiang,ZHU Yan,OUYANG Yan*

(University and College Key Lab of Natural Product Chemistry and Application in Xinjiang,Yili Normal University,Xinjiang Yining 835000,China)

The petroleum extract,ethyl acetate extract and n-butanol extract ofPrunusdivaricataLdb branches and leaves were obtained by systematic solvent extraction,and their antioxidant activities were evaluated by scavenging activity of DPPH radicals,reducing power and total antioxidant activity. The total phenolic content in the obtained extracts were measured. The results showed that the antioxidant activities of the extracts were positively correlated to their total phenolic content,it showed that total phenolic content were main factors for the antioxidant activities. Each part of extracts had antioxidant activities and similar tendency,the ethyl acetate extract displayed the strongest activity,followed by n-butanol extract and the petroleum extract. This indicated that the ethyl acetate extract and n-butanol extract were rich in antioxidant components. The ethyl acetate extract of branches had the strongest activity,remarkably higher than that of BHA. The total phenolic content fromPrunusdivaricataLdb branches and leaves could be produced as natural antioxidants.

PrunusdivaricataLdb;antioxidant activity;total phenolic content;HPLC

2015-06-05

劉偉(1985-)，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail:nculiuwei@126.com。

歐陽(yáng)艷(1965-)，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究、有機(jī)合成，E-mail:ylsyoyy@126.com。

新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計(jì)劃資助(XJEDU2014S061)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)03-0119-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.016