桔梗糖蛋白的組成分析和對·OH的清除作用的研究

廉亞楠,果婷婷,崔　琳,趙勝男,林雪燕,鄭曉鳳,高金波

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)

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桔梗糖蛋白的組成分析和對·OH的清除作用的研究

廉亞楠,果婷婷,崔琳,趙勝男,林雪燕,鄭曉鳳,高金波*

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)

分離純化經(jīng)超臨界CO2輔助提取的桔梗糖蛋白,確定其單糖及氨基酸組成,考察其對·OH自由基的清除作用。以DEAE-52纖維素柱及Sephadex G-75柱分離純化桔梗糖蛋白,分別利用PMP法柱前衍生和OPA-FMOC聯(lián)合衍生測定糖蛋白中單糖和氨基酸的種類與組成,分光光度法檢測桔梗糖蛋白對·OH自由基的清除作用。結(jié)果顯示:桔梗糖蛋白主要由7種單糖及15種氨基酸組成,平均糖含量為61.82%,蛋白含量為33.11%,對·OH的清除能力的IC50值為0.99 mg/mL。由此表明:桔梗糖蛋白具有一定的抗氧化能力,為其用于功能食品、藥物制造等方面發(fā)展提供理論依據(jù)。

桔梗,糖蛋白,組成分析

桔梗為桔梗科(Campanulaceae)植物桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.)A. DC.)的根,別名鈴鐺花、僧冠帽等,是兼食、觀賞、藥用的珍稀經(jīng)濟植物[1-2]。桔梗性平、味苦、辛,具有化痰止咳、利咽開音等功效,桔梗藥用最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》[3-4]。研究表明,桔梗主要含有蛋白質(zhì)、桔梗總皂苷,還含有多聚糖、甾醇類及其糖苷、脂肪油、脂肪酸等成分[5]。糖蛋白(glycoprotein)是由寡糖和多肽鏈共價修飾連接而形成的一類重要生理活性物質(zhì),它廣泛存在于植物、動物體內(nèi)[6-7]。近年來從植物中分離的糖蛋白日益增多[8],由于糖蛋白的種屬專一性,不同植物的糖蛋白具有不同特性,所以本文利用無污染的超臨界CO2萃取技術(shù)對桔梗進行預(yù)處理,再采用超聲波輔助水提醇沉法提取其中的桔梗糖蛋白(Platycodongrandiflorumglycoprotein,PGP),再經(jīng)DEAE-52纖維素柱[9]和Sephadex G-75[10]葡聚糖凝膠柱進行分離純化,獲得了較為純凈的PGP,并對其單糖和氨基酸的組成進行了分析,考察了它對·OH自由基的清除作用,欲為今后的進一步研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

桔梗購于佳木斯藥店,安國市振宇中藥材飲片有限公司,批號2013814,50 ℃烘干粉碎,過篩,收集備用;D-甘露糖(Man),D-(+)半乳糖醛酸(GalUA),D-(+)葡萄糖醛酸(GlcUA),D-阿拉伯糖(Ara)上海藍季科技發(fā)展有限公司；D-半乳糖(Gal),L(+)-鼠李糖(Rha)北京化學(xué)試劑公司；D-木糖(Xyl),葡萄糖(Glc),D-核糖(Rib),巖藻糖(Fuc)上海華精生物高科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)天津市光復(fù)精細化工研究所；鄰苯二甲醛(OPA)化學(xué)純,中國五聯(lián)化工廠；9-芴甲基甲酸酯(FMOC)、DEAE-52纖維素上海源葉生物科技有限公司；Sephadex G-75葡聚糖凝膠上海金穗生物科技有限公司。18種氨基酸,純度:HPLC≥99%,上海源葉生物科技有限公司。

Agilent 1100型高效液相色譜儀(含G1311A四元泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1322A在線真空脫氣機、G1315BDAD二極管陣列檢測器)美國安捷倫責(zé)任有限公司；LG10-2.4A高速離心機北京精力離心機有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1超臨界CO2輔助超聲提取PGP桔梗飲片粉碎過40目篩,加入1 L萃取釜中,在溫度為45 ℃,壓力為25 MPa,夾帶劑乙醇濃度為70%的條件下超臨界萃取1.5 h,將萃取后的桔梗粉末晾干,按料液比桔梗∶蒸餾水=1∶46,在超聲功率為400 W,溫度75 ℃條件下,超聲40 min,紗布過濾,離心,濃縮,80% 以上醇沉,過夜,離心,干燥,得粗PGP粉末。

1.2.2PGP的分離及純化取粗PGP粉末1 g,溶于40 mL蒸餾水中,濕法上DEAE-52纖維素柱,吸附過夜,用純水洗脫,每10 mL為1管收集,用苯酚-硫酸法在490 nm處檢測多糖,在280 nm處檢測蛋白質(zhì),以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線。將同時具有多糖和蛋白質(zhì)的組分合并,透析,濃縮,冷凍干燥,得到PGP半純品。

將PGP半純品100 mg溶于10 mL三蒸水中,上Sephadex G-75 葡聚糖凝膠柱,用純水洗脫,以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線。同上法收集同時具有多糖和蛋白質(zhì)的組分,透析,濃縮,冷凍干燥,得到PGP。

1.2.3多糖與蛋白質(zhì)的含量測定用苯酚-硫酸法測定多糖含量[11],用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量[12-13]。

1.2.4PGP中單糖組成的測定

1.2.4.1色譜條件色譜柱:Agilent Extend-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱;流動相A:0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.7),B:乙腈;流速:1.00 mL/min;檢測波長:245 nm;進樣量:10 μL;柱溫:室溫。梯度洗脫程序為:開始時A為17%,保持到14 min,14.01～22 min,A逐漸降至15%,22.01～34 min,A逐漸降至10%,34.01～65 min,A逐漸升至17%。

1.2.4.2標(biāo)準(zhǔn)單糖混合液的PMP衍生精密稱取Glc,Man,Xyl,L-(-)Fuc,D-Gal,D-Rib,L(+)-Rha,D-Ara,GlcUA和GalUA各30～35 mg,用10 mL氨水溶解。取該標(biāo)準(zhǔn)單糖混合液500 μL與500 μL的PMP/甲醇溶液(0.5 mol/L)混合,在70 ℃下反應(yīng)30 min,取出后冷卻至室溫,用2 mL的氯仿萃取,充分振蕩后除去有機相,重復(fù)3次。

1.2.4.310種單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取衍生后的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 1、4、8、12、16、20 μL在其色譜條件下進行HPLC分析。以各種單糖的物質(zhì)的量(mol/L)為橫坐標(biāo),以各種單糖峰面積的積分值為縱坐標(biāo),繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.4PGP的水解與PMP衍生精確稱取PGP 100 mg于西林瓶中,加入2 mol/L TFA溶液2 mL,用壓蓋器壓蓋,沸水浴加熱40 min,冷卻,取水解液500 μL,同上法衍生[14]。

1.2.4.5單糖組成分析選取5批PGP作為樣品,精密稱量適量,水解,PMP衍生后,取10 μL進樣,重復(fù)5次,根據(jù)出峰的時間和峰面積,確定各單糖的摩爾數(shù)。

1.2.5蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析

1.2.5.1色譜條件色譜柱:ODS HYPERSIL(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:流動相A為0.02 mol/L醋酸鈉溶液(含200 μL/L三乙胺和3.5 mL/L四氫呋喃,2%醋酸溶液調(diào)pH=7.2±0.05),流動相B為0.02 mol/L醋酸鈉溶液-甲醇-乙腈(200∶400∶400,pH=7.2±0.05),柱溫40 ℃,流速:1.00 mL/min;梯度洗脫時間,流動相比例(A:B)和檢測波長分別為:時間:0-20-25-35-45 min;流動相A比例:100%-80%-50%-0%;檢測波長:338-338-254-338 nm。

1.2.5.218種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取18種氨基酸 0.10 ～ 0.11 g,分別溶于0.1 mol/L的鹽酸溶液中,定容于10 mL容量瓶中,得各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的貯備液。

1.2.5.3混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取以上各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.00 mL,置于25 mL量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸溶液定容。

1.2.5.4PGP的水解精確稱取PGP純品20 mg,置于20 mL西林瓶中,加入6 mol/L鹽酸15 mL,用壓蓋器壓蓋。置于110 ℃恒溫干燥箱中水解24 h,冷卻后,蒸干,然后加入1%鹽酸2.00 mL,超聲10 min,備用。

1.2.5.5氨基酸在線衍生自動進樣程序吸取OPA溶液15 μL,洗針,再吸取待測液20 μL,洗針,混合,等待2 min后,再吸取FMOC 15 μL,洗針,進樣[15-16]。

1.2.5.618種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用自動進樣器分別取混合氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液1、5、10、15、20、25 μL,按照1.2.5.5 氨基酸在線衍生自動進樣程序衍生進樣,以測得的各種氨基酸的峰面積為縱坐標(biāo),以各種氨基酸的進樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)。

1.2.5.7氨基酸的組成分析取PGP的水解液,按在線衍生自動進樣程序進樣分析,根據(jù)出峰時間進行組成分析,根據(jù)色譜峰的峰面積計算各氨基酸的含量。

1.2.6羥基自由基的生成和清除率的測定利用Fenton反應(yīng)體系[17-18],檢測PGP對羥基自由基清除作用。取0.15 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH7.4)1.00 mL,0.258 mg/mL番紅花紅T溶液200 μL,6 mmol/L的EDTA-Na+Fe2+1.00 mL,然后分別加入7.00 mL不同質(zhì)量濃度(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL)的PGP,后加入0.8 mL的3%的過氧化氫,放入40 ℃水浴30 min后,在520 nm處測吸光度值。

式中:A1-體系中未加樣品溶液時的吸光度;AS-體系中加了樣品溶液時的吸光度;A2-番紅花紅和緩沖溶液混合后的吸光度。

2　結(jié)果與討論

2.1雙柱法對PGP分離純化的影響

DEAE-52柱和Sephadex G-75柱的洗脫曲線分別見圖1和圖2。圖1中9～16洗脫管為多糖與蛋白質(zhì)的重疊峰。圖2中20～30洗脫管為多糖與蛋白質(zhì)的重疊峰。通過兩柱的分離純化,足以說明多糖與蛋白質(zhì)為一結(jié)合體。

圖1　DEAE-52柱洗脫曲線Fig.1　Gradient elution curve of DEAE-52 column

圖2　Sephadex G-75洗脫曲線Fig.2　Gradient elution curve of Sephadex G-75 column

2.2PGP中多糖與蛋白質(zhì)的含量

本實驗對PGP中多糖與蛋白質(zhì)的含量測定結(jié)果為:多糖的平均含量為61.82%,蛋白質(zhì)的平均含量為33.11%。結(jié)果表明,PGP中多糖的含量大于蛋白質(zhì)的含量,約為蛋白質(zhì)含量的2倍。

2.3PGP中單糖的組成分析

2.3.1單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程圖3為標(biāo)準(zhǔn)單糖PMP衍生物的色譜圖。回歸所得工作方程,相關(guān)系數(shù)及線性范圍,見表1,用于單糖組成比的計算。

圖3　單糖標(biāo)準(zhǔn)品PMP衍生物色譜圖Fig.3　Chromatogram of monosaccharide standard by PMP derivatives注:0:PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮),1:Man(甘露糖),2:Rib(核糖),3:Rha(鼠李糖),4:GlcUA(葡萄糖醛酸),5:GalUA(半乳糖醛酸),6:Glc(葡萄糖),7:Gal(半乳糖),8:Xyl(木糖),9:Fuc(巖藻糖),10:Ara(阿拉伯糖)。

2.3.2PGP的單糖組成圖4為桔梗糖蛋白中多糖水解衍生物色譜圖。通過圖3與圖4的對比可知,桔梗糖蛋白中的多糖主要由葡萄糖醛酸,半乳糖醛酸,葡萄糖,半乳糖,木糖,巖藻糖,阿拉伯糖7種單糖組成,經(jīng)計算其摩爾比為5.844∶3.373∶15.20∶4.616∶4.089∶5.274∶6.171。

表1　各種單糖及糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1　Standard curve of standard monosaccharide

圖4　桔梗糖蛋白中多糖水解衍生物色譜圖Fig.4　Derivative chromatogram of Platycodon grandiflorum hydrolysis in glycoprotein polysaccharide注:1:GlcUA(葡萄糖醛酸),2:GalUA(半乳糖醛酸), 3:Glc(葡萄糖),4:Gal(半乳糖),5:Xyl(木糖), 6:Fuc(巖藻糖),7:Ara(阿拉伯糖)。

2.4PGP中的氨基酸組成分析

2.4.118種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立由實驗得到18 種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍(見表2)。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖5。

圖5　氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品Fig.5　HPLC chromatograms of amino acid mixed standards注:1:Asp(天門冬氨酸),2:Glu(L-谷氨酸),3:His(組氨酸),4:Thr(蘇氨酸),5:Gly(甘氨酸),6:Ala(丙氨酸),7:Tyr(酪氨酸),8:Arg(精氨酸),9:Val(纈氨酸),10:Met(蛋氨酸),11:Phe(苯丙氨酸),12:Ile(異亮氨酸),13:Pro(脯氨酸),14:Cys(胱氨酸),15:Leu(亮氨酸),16:Trp(色氨酸),17:Lys(賴氨酸),18:Ser(絲氨酸)。表2　18種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2　Regression equations and linear ranges of 18 kinds of amino acids

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)線性范圍(μg)天冬氨酸y=47.14x-4.4070.99920.4024～8.048谷氨酸y=48.60x-8.5550.99450.4016～8.031絲氨酸y=48.45x-4.1290.99660.4004～8.007組氨酸y=48.28x-2.3180.99790.4024～8.047甘氨酸y=48.41x-5.7050.99650.4048～8.107蘇氨酸y=49.94x-8.5410.99790.4016～8.028胱氨酸y=48.53x-9.3290.99650.4052～8.102丙氨酸y=26.38x-5.3430.99760.4040～8.080精氨酸y=48.39x-0.61180.99840.4004～8.007纈氨酸y=46.37x-6.9740.98160.4068～8.136酪氨酸y=49.53x-6.25110.99830.4008～8.016蛋氨酸y=48.78x-8.0670.99750.4068～8.136色氨酸y=47.74x-2.7910.99200.4020～8.040苯丙氨酸y=49.29x-21.230.98350.4000～7.998異亮氨酸y=48.56x-4.3340.99650.4048～8.095亮氨酸y=46.88x-8.3070.99400.4052～8.104脯氨酸y=550.61x-52.930.99740.4064～8.128賴氨酸y=401.53x-66.200.99600.4048～8.096

2.4.2PGP中氨基酸的組成圖6為PGP水解液的色譜圖。通過圖5與圖6的對比可知:桔梗糖蛋白的氨基酸主要由谷氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、賴氨酸等15種組成,總量為224.8 mg/g,各氨基酸的質(zhì)量分布見圖7。其中,含有全部人體必需氨基酸,占總氨基酸的76.15%。

圖6　糖蛋白中氨基酸組成色譜圖Fig.6　The chromatograms of amino acids in glycoprotein注:1:Glu(L-谷氨酸),2:Thr(蘇氨酸),3:Gly(甘氨酸),4:Ala(丙氨酸),5:Tyr(酪氨酸),6:Arg(精氨酸),7:Val(纈氨酸),8:Met(蛋氨酸),9:Phe(苯丙氨酸),10:Ile(異亮氨酸),11:Pro(脯氨酸),12:Cys,13:Leu(胱氨酸),14:Trp(色氨酸),15:Lys(賴氨酸)。

圖7　糖蛋白中氨基酸組成質(zhì)量分布圖Fig.7　Mass distribution of amino acid in glycoprotein

2.5PGP對·OH自由基清除能力的影響

桔梗糖蛋白對·OH自由基的清除實驗結(jié)果見圖8。

圖8　PGP對·OH自由基的清除的能力(n=3)Fig.8　Scavenging capability on ·OH free radicals(n=3)

結(jié)果顯示,桔梗糖蛋白對·OH自由基的清除能力隨濃度的增加而增大,且PGP與VC的IC50值分別為:0.99 mg/mL和0.29 mg/mL,當(dāng)濃度達到2.5 mg/mL以上時PGP與VC的清除能力基本相當(dāng),表現(xiàn)出良好的對·OH的清除能力。

3　結(jié)論

本實驗采用超臨界CO2萃取與超聲波振蕩輔助提取法得到的桔梗糖蛋白(PGP),經(jīng)由雙柱(DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱)分離純化,獲得了較為純凈的PGP之后,對其多糖和蛋白質(zhì)的含量和組成進行了測定與分析,同時測定了PGP對·OH自由基清除能力,并與VC進行了比較。結(jié)果顯示,PGP由7種單糖及15種氨基酸組成,其中多糖的含量占61.82%,蛋白含量占33.11%,蛋白質(zhì)中含有必需的8 種氨基酸,占總氨基酸的76.15%;對·OH自由基的清除PGP和VC的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為0.99 mg/mL和0.29 mg/mL,當(dāng)濃度大于2.5 mg/mL時,對·OH的清除能力較強,且與VC相當(dāng)。表明PGP具有一定的抗氧化能力,本研究為桔梗的開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(第一部)[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:259-260.

[2]徐麗萍,李笑梅,王鑫. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化桔梗皂甙提取工藝[J]. 食品科學(xué),2010,31(12):49-53.

[3]張蓮姬,南昌希,張麗霞. 桔梗多糖的提取及其抗氧化作用研究[J]. 食品與機械,2008,24(03):60-63.

[4]郭麗,張村,李麗,等. 中藥桔梗的研究進展[J]. 中國中藥雜志,2007,32(3):181-185.

[5]譚玲玲,彭華勝,胡正海. 桔梗的生物學(xué)特性及化學(xué)成分研究進展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,42(12):1523-1527.

[6]Li Lei,Zhang Jinping,Zhou Quancheng. Optimization of microwave-assisted extraction of polysaccharides in the flower of Platycodon grandiflorum by response surface methodology[J]. Int J Agric & Biol Eng,2009,2(2):65-74.

[7]Yeo Dae Yoon,Sang Bae Han,Jong Soon Kang. Toll-like receptor 4-dependent activation of macrophages by polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorum[J].International Immunopharmacology,2003(3):1873-1882.

[8]杜曉旭,鐘潔,段玉峰,等. 蒲公英糖蛋白的分離純化與結(jié)構(gòu)分析[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(8):198-201.

[9]孫宇婧,韓濤,卞科,等. 山藥糖蛋白純化條件及其理化方法鑒定[J]. 中國糧油學(xué)報,2011,26(3):81-85.

[10]楊新河,黃建安,劉仲華,等. 樹脂對普洱茶多糖的純化與分離[J]. 食品科學(xué),2015,36(02):19-24.

[11]劉曉涵,陳永剛,林勵,等. 蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較[J]. 食品科技,2009,34(9):270-272.

[12]劉玉明,錢甜甜,蔣定文,等. 凱氏定氮法和考馬斯亮藍法測定方格星蟲多糖中蛋白質(zhì)的含量[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志,2010,19(19):96-98.

[13]魯健章,孫麗華,周彥鋼. 凱氏定氮法測定魚蛋白質(zhì)含量的干擾因素分析[J]. 食品科學(xué),2010,31(19):453-456.

[14]田鑫,盛文靜,趙園園,等. 刺參多糖中糖醛酸氨基糖和中性單糖的同步測定方法研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(15):85-89.

[15]陳華萍,陳黎,魏育明,等. 柱前衍生反相高效液相色譜法測定小麥中氨基酸含量[J]. 分析化學(xué),2005,33(12):1689-1692.

[16]葉英. OPA-FMOC柱前衍生反相液相色譜法測定氨基酸含量[J]. 食品科學(xué),2002,23(9):91-93.

[17]王恒超,嚴靜,陳錦屏,等. 微波輔助法提取柿子黃酮及抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(18):232-235.

[18]王呈文,紀明慧,陳光英,等. 熱帶莫氏蘭根提取物的抗氧化活性及穩(wěn)定性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(05):209-211.

Study on the composition analysis and inhibition of·OH of glycoprotein fromPlatycodongrandiflorum

LIAN Ya-nan,GUO Ting-ting,CUI Lin,ZHAO Sheng-nan,LIN Xue-yan,ZHENG Xiao-feng,GAO Jin-bo*

(College of Pharmacy,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Separation and purification of glycoprotein which were extracted by super critical CO2fromPlatycodongrandiflorum. Then the monosaccharide and amino acids composition and the inhibition of ·OH of glycoprotein were investigated.The glycoprotein were extracted fromPlatycodongrandiflorumand purified by DEAE-52 cellulose column and Sephadex G-75 gel column. Monosaccharide and amino acids of glycoprotein were analyzed by pre-column derivatization with PMP and OPA-FMOC respectively. The results showed thatPlatycodongrandiflorumglycoprotein was composed of 7 kinds of monosaccharide(average content of 61.82%)and 15 kinds of amino acids(average content of 33.11%). IC50value of inhibition ·OH was 0.99 mg/mL. The study showed that ·OH could be inhibited by thePlatycodongrandiflorumglycoprotein effectively,which provided the theoretical basis for the further study on functional food and the drugs manufacture.

Platycodongrandiflorum;glycoprotein;analysis of composition

2015-07-09

廉亞楠(1993-)，女，本科，研究方向：天然產(chǎn)物藥物分析，E-mail:1263238105@qq.com。

高金波(1960-)，女，本科，教授，研究方向：天然產(chǎn)物藥物分析，E-mail:gaojinbo2001@163.com。

佳木斯大學(xué)大學(xué)生“校長創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項目”研發(fā)項目課題(xzyf2013-07);佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(2014-013);佳木斯大學(xué)大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目(LM2015-095)。

TS201.5

A

1002-0306(2016)03-0083-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.008