金絲小棗低聚糖的制備及其體外活性研究

尹碩慧,趙瑩彤,羅　歡,布　蕾,馬　珺,任迪峰,*,魯　軍

(1.北京林業大學生物科學與技術學院食品系、林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083) (2.中國食品發酵工業研究院、北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京 100015)

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金絲小棗低聚糖的制備及其體外活性研究

尹碩慧1,2,趙瑩彤1,羅歡1,布蕾1,馬珺1,任迪峰1,*,魯軍2,*

(1.北京林業大學生物科學與技術學院食品系、林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083) (2.中國食品發酵工業研究院、北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京 100015)

為探索金絲小棗低聚糖提取工藝及其生物活性,開發利用金絲小棗的營養功能價值,本文以酸解結合酶解的方法對金絲小棗多糖進行降解,利用正交法優化制備工藝。以3-氨基-9-乙基咔唑作為衍生劑對所制備的低聚糖進行HPLC柱前衍生,分析其單糖組成,并對其抑制食物腐敗菌的活性及抗氧化性進行體外實驗研究。結果表明,以0.5 mol/L的三氟乙酸,80 ℃水解小棗多糖6 h;對所得沉淀以0.05 mg/mL果膠酶在45 ℃下酶解40 min,可較高效率獲得金絲小棗低聚糖,其得率為:24.87%±0.63%。單糖組分分析最佳色譜條件為:流動相28∶52,乙腈-水(0.1 mol/L醋酸銨緩沖液,pH4.3);流速0.8 mL/min;UV 254 nm。所制備的小棗低聚糖經測定具有抑菌活性,對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為0.195、0.781、0.391 mg/mL,且具有一定的抗氧化能力,在其濃度為25 mg/mL時,總抗氧化能力為(4.69±0.14) U,DPPH·清除率為57.71%±0.51%,·OH清除率為35.24%±1.08%。說明金絲小棗具有功能營養開發利用的價值。

金絲小棗低聚糖,生物活性,抑菌,抗氧化

低聚糖(oligosaccharides)大多具有一定的生物活性與營養價值,在促進動植物生長、抑菌、抗癌等方面有重要作用[1-3],通常以天然植物多糖進行降解得到。目前,國內外有關植物多糖制備低聚糖的研究多采用蘋果、柑橘、橘皮等為原料進行果膠多糖的提取以及低聚糖的制備[4-7]。

金絲小棗,是我國栽培面積和產量最大的棗品種之一,與其他品種相比有較高的含糖量和較長的貯藏期,但是可食率和風味較低[8],孫曙光等[9]研究金絲小棗濃縮汁發現其多糖含量達95%以上,且灰分以及蛋白質含量較低,適合作為多糖的提取原料。趙智慧等[10-11]對金絲小棗水溶性多糖進行了研究,發現小棗多糖中含有大量的半乳糖醛酸,認為金絲小棗多糖的主要類型為果膠多糖。然而,目前對于棗類多糖制備低聚糖的研究較少,一般采取從棗中直接提取的方法[12-13],同時缺乏對小棗低聚糖組成的分析。Fanaro[14]等發現果膠多糖降解制備產物對腸道菌群有一定的益處;王向紅[13]等發現金絲小棗低聚糖具有對雙歧桿菌的體外促生長功能。然而,金絲小棗低聚糖的其他生物活性還有待研究。

低聚糖的降解制備方法主要有化學法和酶解法兩種[15-16]。但是,酸解法不易控制反應進程,且產物不適宜直接在食品領域應用;而酶解法條件溫和,不能達到很好的降解效果[17]。因此,本實驗以金絲小棗為材料,利用酸解法與酶解法相結合,輔以超聲波處理和超濾,降解制備金絲小棗低聚糖。同時,利用柱前衍生法分析其單糖組成,并對其抑制食物腐敗菌的活性以及抗氧化進行體外實驗研究,為金絲小棗資源的深度開發提供理論依據,有利于拓寬棗類多糖的研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

金絲小棗由滄州宏偉食品有限公司提供;果膠酶(酶活>40 U/mg)寧夏和氏璧生物技術有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubltillus)由北京林業大學生物科學與技術學院生物系微生物實驗室提供;半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha),LANYI試劑公司;阿拉伯糖(Ara)Sigma公司;半乳糖醛酸(GalA),Fluka公司;木糖(Xyl)北京奧博星生物技術有限責任公司;葡萄糖(Glc)、醋酸銨緩沖液西隴化工股份有限公司;三氯乙酸(TFA)北京市興津化工廠;3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、NaBH3CN日本;總抗氧化能力檢測試劑盒(T-AOC)南京建成生物工程研究所;甲醇溶液、乙腈國產色譜純;其他試劑為國產分析純。

高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司;KQ3200DE型數控超聲波粉清洗器昆山市超聲儀器有限公司;臺式高速離心機 H/T16MM湖南赫西儀器裝備有限公司;DZF真空干燥箱上海龍躍儀器設備有限公司;DHJ-9033B5-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱上海新苗醫療器械制造有限公司;FD-1冷凍干燥機北京德天佑科技發展有限公司;SPD-M20A高效液相色譜儀島津公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業有限公司醫療設備廠;722型可見分光光度計上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1金絲小棗多糖的提取將金絲小棗去核后烘干,粉碎備用。取500 g棗粉,優化李進偉[18]的實驗條件,提取金絲小棗多糖,即采用超聲波法,以蒸餾水溶解棗粉,料液比1∶20(v/v),提取功率90 W,時間20 min,得金絲小棗粗多糖溶液。溶液離心,取上清液,減壓濃縮,調含醇量至80%,靜置過夜,取沉淀。依次用無水乙醇、丙酮洗脫并離心,取上清液過聚酰胺柱進行脫色,對流出液再次調含醇量至80%,靜置過夜,取沉淀,冷凍干燥后得金絲小棗精多糖。

1.2.2金絲小棗低聚糖的制備稱取0.2 g小棗精多糖,用4 mL TFA溶液對多糖進行酸水解,調節各個水解條件,反應條件及因素水平見表1。一定時間后將溶液于6000 r/min離心10 min,取沉淀。并根據王丹波[19]關于溫度對果膠酶水解反應影響的研究結果,選擇在45 ℃的水浴條件下,用不同濃度(0.025、0.05、0.075 mg/mL)的果膠酶解液進行酶解,分別于40、60、80 min時取樣,利用咔唑比色法[20]測定產物吸光度值。配制標準半乳糖醛酸溶液,制定標準曲線,并以產物吸光度值對比所作標準曲線計算出在不同水解條件下所得小棗低聚糖的含量。根據最優條件下所得金絲小棗低聚糖的濃度,計算其得率,公式如下:

金絲小棗低聚糖得率(%)

表1　因素水平表Table 1　Factors level of orthogonal test

1.2.3金絲小棗低聚糖成分分析等摩爾配制0.1 mol/L的混合標準單糖溶液(半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖)作為標樣,根據孫靜[17]通過AEC-HPLC柱前衍生化對金絲小棗低聚糖的單糖組成進行分析,用具有紫外吸收的衍生化試劑(AEC)與糖類物質反應,使糖類物質帶上紫外吸收基團,通過HPLC的紫外檢測器進行檢測,對比標準樣品色譜圖進行分析。同時進行色譜條件的優化:保持pH4.3,流速0.8 mL/min,柱溫 25 ℃不變,改變流動相乙睛含量,結合不同UV值的圖譜分離情況,確定乙腈與醋酸銨緩沖液的最佳配比。

1.2.4金絲小棗低聚糖的抑菌作用研究以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌為對象菌,制備各供試菌的菌懸液。配制500 mL牛肉膏蛋白胨培養基,將各供試菌種經斜面培養基活化,分別用無菌水配制成每毫升含菌數為106～108個的菌懸液。

表3　方差分析表Table 3　Variance analysis of orthogonal test

注:*:在0.05水平下差異顯著。

采用打洞法[21],實驗重復3次,選取抑菌圈直徑的平均值,通過判斷抑菌圈大小判定小棗低聚糖的抑菌活性。采用二倍稀釋法[22]測定樣品對于各實驗菌種的MIC值,在波長為600 nm測定其吸光度值。平行進行三組實驗,選取平均值。

1.2.5金絲小棗低聚糖體外抗氧化實驗取最佳降解條件下所得樣品,配制成不同濃度(5、10、15、20、25 mg/mL)的寡糖溶液,采用還原法測定小棗低聚糖的總抗氧化能力[23]。選用南京建成生物工程研究所生產的總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒進行實驗。按周忠波等[24]的方法測定·OH清除率,即依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4和水楊酸-乙醇溶液,1 mL 甲醇溶液及1 mL 8. 8 mmol/L H2O2,在37 ℃水浴加熱30 min,以甲醇作參比,在510 nm下測定其吸光度A0。以1 mL的5、10、15、20、25 mg/mL樣品溶液,替換甲醇溶液,測定510 nm處吸光度AX。將8.8 mmol/L H2O2換為甲醇溶液,測定其吸光值AX0。實驗重復3次。按李永裕等[25]的方法測定小棗低聚糖DPPH·清除率,分別吸取1 mL 的5、10、15、20、25 mg/mL樣品溶液,各加入1 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,搖勻,避光暗處放置30 min。以無水乙醇作為空白對照,在517nm波長處測定吸光度Al。同時,測定1 mL無水乙醇和1 mL DPPH混合液的吸光度A0。實驗重復3次。

2　結果與分析

2.1金絲小棗低聚糖制備的最佳條件

2.1.1金絲小棗多糖的酸水解工藝優化棗粉按1.2.1節提取方案浸提,經除雜、醇沉后得金絲小棗精多糖。根據預實驗結果,按1.2.2所述,選用TFA溶液濃度、酸解溫度、酸解時間為主要考察因素,利用正交實驗設計對金絲小棗多糖的TFA溶液酸解工藝條件進行探究,以確定最佳酸解條件。不同條件下樣品處理結果如表2所示,方差分析結果見表3。

表2　L9(33)正交實驗設計及結果表Table 2　Orthogonal array design arrangement and the experimental data

由表2可以看出,對極差R進行分析,三個變量因素RC>RB>RA,因素C(酸解時間)的極差R為0.0330最大,是主要影響因素。根據K值進行分析,得出TFA溶液酸解金絲小棗多糖的最佳工藝條件為C3B2A2,即TFA溶液濃度0.5 mol/L,酸解溫度80 ℃,酸解時間6 h,此條件進行酸解實驗產物質量為0.0988 g。對表3進行方差分析,發現酸解時間對于酸解產物質量的影響在顯著性水平0.05上顯著,而TFA溶液濃度、酸解溫度對酸解產物質量的影響不顯著。

2.1.2金絲小棗多糖酸水解后所得沉淀的酶解工藝優化配制標準半乳糖醛酸溶液,制定標準曲線如圖1。以最佳條件酸解后的產物為原料,用果膠酶于45 ℃水浴條件下進行酶解。選用酶濃度、酶解時間為探究因素,利用咔唑比色法測定產物吸光度值,對金絲小棗多糖酸水解后所得沉淀的酶解工藝條件進行探究,實驗結果見表4。

圖1　半乳糖醛酸標準曲線Fig.1　The standard line of Galacturonic acid表4　酶解優化實驗設計及結果表Table 4　Orthogonal array design arrangement and the experimental data

實驗號酶液濃度(mg/mL)反應時間(min)產物濃度(mg/mL)10.0254016.4320.025606.7630.025806.9640.054016.5750.05607.3260.058014.0770.075409.5980.075606.9090.0758010.96

實驗結果表明,酶解液濃度為0.05 mg/mL,且反應40 min時產物濃度最高,為16.57 mg/mL。即果膠酶酶解金絲小棗酸解產物的最佳條件為:酶液濃度0.05 mg/mL,水浴反應溫度45 ℃,反應時間40 min。經重復實驗,得小棗低聚糖得率為:24.87%±0.63%。

表5　不同濃度金絲小棗低聚糖處理實驗菌的OD600值Table 5　OD600 values of lab strains dealt with different concentrations of ZizyphusJujuba cv. Jinsixiaozao oligosaccharides

2.2金絲小棗低聚糖HPLC柱前衍生化法分析

經研究,乙腈與醋酸銨緩沖液的最佳配比為28∶52。取衍生化好的標品及樣品進行HPLC分析,色譜條件為:流動相,28∶52的乙睛-水(0.1 mol/L的醋酸銨緩沖液,pH4.3);流速 0.8 mL/min;柱溫 25 ℃;UV 254 nm。實驗結果見圖2。

圖2　6種單糖標準品 以及金絲小棗低聚糖的AEC-HPLC圖譜Fig.2　AEC-HPLC maps of the six monosaccharide standards and the ZizyphusJujuba cv. Jinsixiaozao oligosaccharides注:1.GalA,2.Gal,3.Glc,4.Ara,5.Xyl,6.Rha。

由圖2可以得出,制備所得的金絲小棗低聚糖的主要單糖成分有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖6種,其相對百分含量比值為52.07∶9.27∶6.22∶18.28∶8.40∶5.76。

2.3金絲小棗低聚糖的抑菌作用實驗結果與分析

根據1.3.4的方法進行實驗,以無菌水為對照,通過觀察抑菌圈的大小來判斷金絲小棗低聚糖對于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及金黃色葡萄球菌3種供試菌的抑菌效果。抑菌圈大,則金絲小棗低聚糖對該菌種的抑菌效果好。實驗結果見圖3。

圖3　金絲小棗低聚糖的抑菌實驗結果Fig.3　Antibacterial activity of ZizyphusJujuba cv. Jinsixiaozao oligosaccharid

最小抑菌濃度的測定結果均值如表5。通過計算,選擇p<0.05時的OD值所對應的金絲小棗低聚糖濃度,為金絲小棗低聚糖對該菌的最低抑菌濃度。

從圖3可以看出,金絲小棗低聚糖對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌,皆有一定的抑菌作用,抑菌圈直徑分別為11.90±0.32、10.93±0.12、(9.97±0.12)mm。金絲小棗低聚糖對于細菌的抑制活性為大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌。

由表5并結合計算可以得出,金絲小棗低聚糖在濃度等于0.195、0.391、0.781 mg/mL時對應大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的OD值,在t檢驗下的p值依次為0.017、0.027、0.016。且金絲小棗低聚糖濃度大于上述值時,對應實驗菌的OD值在t檢驗下均顯著(p<0.05)。因此金絲小棗低聚糖對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度(MIC)依次為0.195、0.391、0.781 mg/mL,其中大腸桿菌的MIC值最小,抑制效果最好。

2.4金絲小棗低聚糖的抗氧化實驗結果與分析

抗氧化劑清除自由基是由于自身的還原作用給出電子[26],其還原力(總抗氧化力)強則抗氧化能力強,因此總抗氧化力強弱可以反映抗氧化活性的大小。樣品的總抗氧化能力(U)曲線如圖4a。

DPPH·是一種穩定存在的有機自由基,由于可以快速、靈敏、穩定的測定,廣泛用于物質抗氧化性的評價[27],此外清除·OH也是常用的評價抗氧化能力的方法之一。樣品的自由基清除率作用曲線如圖4b。

圖4　金絲小棗低聚糖的氧化能力測定Fig.4　The anti-oxidative effect of ZizyphusJujubacv. Jinsixiaozao oligosaccharides

結果顯示,金絲小棗低聚糖具有明顯的總抗氧化能力以及DPPH·、·OH清除能力,氧化效果隨著其濃度的增加呈現上升趨勢,且相比之下對于DPPH·的清除能力強于·OH。在金絲小棗低聚糖濃度為25 mg/mL時,其總抗氧化能力為(4.69±0.14)U,DPPH·清除率為57.71±0.51%,·OH清除率為35.24%±1.08%。因此,金絲小棗低聚糖具有一定的抗氧化能力,且隨濃度升高,抗氧化能力增強。

3　結論

采用酸解結合酶解的方法制備金絲小棗低聚糖,其最佳降解條件為:0.5 mol/L的TFA溶液80 ℃水解小棗多糖6 h;對所得沉淀再以0.05 mg/mL的酶解液,45 ℃酶解40 min。小棗低聚糖的得率為:24.87%±0.63%。

HPLC對金絲小棗低聚糖樣品進行成分分析的最佳色譜條件:流動相為28∶52,乙腈-水(0.1 mol/L的醋酸銨緩沖液,pH4.3);流速0.8 mL/min;UV 254 nm。液相色譜分析結果表明:金絲小棗低聚糖組成為半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖,其相對百分含量比為52.07∶9.27∶6.22∶18.28∶8.40∶5.76。

金絲小棗低聚糖對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌,皆有一定的抑菌作用,抑菌圈直徑分別為11.90±0.32、10.93±0.12、(9.97±0.12) mm,抑制活性為大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌,最小抑菌濃度依次為0.195、0.391、0.781 mg/mL。

金絲小棗低聚糖具有總抗氧化能力以及對DPPH·、·OH的清除能力,且抗氧化性能隨著濃度升高增強。在金絲小棗低聚糖濃度為25 mg/mL時,其總抗氧化能力為(4.69±0.14)U,DPPH·清除率為57.71%±0.51%,·OH清除率為35.24%±1.08%。

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Preparation and bioactivitiesinvitroof oligosaccharides fromZizyphusJujubacv.Jinsixiaozao

YIN Shuo-hui1,2,ZHAO Ying-tong1, LUO Huan1,BU Lei1,MA Jun1,REN Di-feng1,*,LU Jun2,*

(1.Beijing Key Laboratory of Forestry Food Processing and Safety,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China；2.Beijing Engineering Research Center of Protein & Functional Peptides,China National Research Institute of Food & Fermentation Industries,Beijing 100015,China)

To explore the extraction process and bioactivities of oligosaccharides fromZizyphusJujubacv.Jinsixiaozaoas well as utilization of its nutrition value,the methods of acidolysis and enzymolysis were employed to degrade polysaccharides inJinsixiaozao,and the preparation process was optimized orthogonally. The composition of monosaccharide was analyzed by high performance liquid chromatography after precolumn derivation of oligosaccharides using 3-amino-9-ethylcarbazole as the derivating agent.Invitroassays were also conducted to investigate the antioxidant activity and inhibitory effects on food spoilage bacteria.Jinsixiaozaooligosaccharides were prepared efficiently by using 0.5 mol/L trifluoroaceticacid(TFA)to hydrolyzeJinsixiaozaopolysaccharideat 80 ℃ for 6 h,following by enzymatic hydrolysis of the resulting precipitation at 45 ℃ for 40 min by 0.05 mol/L pextaseon,and its yield was 24.87%±0.63%. The chromatographic conditions for analyzing of the monosaccharide composition were mobile phase,acetonitrile-water 28∶52(0.1mol/L ammonium acetate buffer,pH4.3),flow velocity,0.8 mL/min,detection wavelength,254 nm. The results indicated that theJinsixiaozaooligosaccharide extraction possessed inhibitory activities on bacteria,with minimal inhibitory concentrations oncolibacillus,bacillussubtilisandS.aureusat0.195,0.781,0.391 mg/mL respectively. The extract also had a certain antioxidant capacity,of which the total antioxidant capacity was(4.69±0.14)U,the DPPH· scavenging rate was 57.71%±0.51%,and the OH· scavenging rate was 35.24%±1.08% at a concentration of 25 mg/mL,respectively. All of these indicated thatJinsixiaozaohad a value for development and utilization of its health-care functions.

ZizyphusJujubacv.Jinsixiaozao;oligosaccharide;bioactivity;bacteriostasis;antioxidation

2015-07-13

尹碩慧(1994-)，女，本科，研究方向：食品科學,E-mail：bestwishyinsh@126.com。

任迪峰(1973-)，女，博士，教授,研究方向：食品營養與生物技術,E-mail：rendifeng@bjfu.edu.cn。

魯軍(1973-)，男，博士，高級工程師，研究方向：功能性食品, E-mail：johnljsmith@163.com。

國家林業公益性行業科研專項資金(201304805)；國家自然科學基金項目(31201339、31571772)；北京市大學生科學研究與創業行動計劃項目(S201410022039)；國家“863”計劃項目(2013AA102205)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD33B04)；北京市科技北京百名領軍人才培養工程項(Z131110000513026)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)03-0063-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.004