香蕉莖稈汁液抑制晚期糖基化終末產物活性評價

商文婷,盛占武,谷滿屯,鄭麗麗,艾斌凌,楊勁松

(1.海南大學食品學院,海南海口 570228;2.中國熱帶農業科學院海口實驗站,海南海口 570102;3.海南省香蕉遺傳改良重點實驗室,海南海口 570102)

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香蕉莖稈汁液抑制晚期糖基化終末產物活性評價

商文婷1,2,盛占武2,3,*,谷滿屯1,2,鄭麗麗2,3,艾斌凌2,3,楊勁松1,*

(1.海南大學食品學院,海南海口 570228;2.中國熱帶農業科學院海口實驗站,海南海口 570102;3.海南省香蕉遺傳改良重點實驗室,海南海口 570102)

為研究香蕉莖稈汁液抑制晚期糖基化終末產物(AGEs)活性,選用α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制模型研究其對碳水化合物代謝關鍵酶的抑制作用,并采用Lineweaver-Burk雙倒數法研究其動力學性質。同時對AGEs的抑制和清除ABTS+·的能力也進行了評價。結果表明,香蕉莖稈汁液對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度(IC50)為1.51 mg/mL,對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為混合型抑制。香蕉莖稈汁液對α-淀粉酶的半抑制濃度(IC50)是8.64 mg/mL,抑制類型為不可逆抑制。通過實驗研究,香蕉莖稈汁液具有一定清除ABTS+·的能力,對牛血清白蛋白果糖模型AGEs也具有一定的抑制作用。香蕉莖稈汁液可抑制體外AGEs的生成。

香蕉莖稈汁液,α-葡萄糖苷酶,α-淀粉酶,晚期糖基化終末產物

晚期糖基化終末產物(AGEs)是在非酶糖基化反應過程中,蛋白質、氨基酸、脂類或核酸等大分子物質的游離氨基與還原糖(葡萄糖、果糖、戊糖等)的醛基經過縮合、重排、裂解、氧化修飾后產生的一組穩定的聚合產物[1]。AGEs 分為內源性和外源性。內源性 AGEs是由生物機體內的糖類與蛋白質發生糖化反應而產生的。而外源性 AGEs是指人體從外部攝入或來源于食品的 AGEs,如煙草等[2]。內源性AGEs會增加體內氧化應激性,促進腫瘤壞死因子α、白細胞介素-22等炎癥性細胞因子生成,進而誘發多種慢性疾病如糖尿病、腎病、白內障、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病、阿茨海默爾病、類風濕性關節炎等[3]。外源性的AGEs通過飲食、生活多種途徑能夠在體內快速聚積,機體就會出現病理變化[4-5]。阻斷非酶糖基化反應是抑制AGEs生成的有效途徑。在美拉德反應、葡萄糖氧化、脂質過氧化和多元醇途徑中,具有抗氧化、清除活性羰基、抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的物質可阻斷非酶糖基化反應,進而達到抑制AGEs生成的目的[6]。

香蕉不僅是一種富含碳水化合物、維生素和礦物質的營養水果而且它的花、莖稈以及葉子也含許多次級代謝物[7]。在印度,香蕉還被用于治療胃潰瘍、高血壓、腹瀉、痢疾和糖尿病等[8]。有文獻已經證明某些植物的莖、果實、根和花具有治療糖尿病的作用[9]。在傳統的使用中,香蕉提取物被用作衣物或纖維的媒染劑或一種可以將動物的皮毛轉變成皮革的試劑[10]。近幾年,香蕉莖稈汁液也開始被人們關注,有文獻證實香蕉莖稈汁液提取物有止血和促進傷口愈合的功效,也被作為抗菌和抗炎的藥物[11-12]。通過LC-MS檢測到香蕉莖稈汁液中也含有多酚和黃酮類物質,所以由此可以判斷香蕉莖稈汁液提取物可以作為抑制AGEs的天然抑制劑[13]。本文通過研究香蕉莖稈汁液對α-葡萄糖苷酶,α-淀粉酶和牛血清白蛋白-果糖模型的抑制作用、動力學特征及其抗氧化活性,旨在闡明香蕉莖稈汁液對體外AGEs生成的影響,為香蕉莖稈汁液的開發利用奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

α-葡萄糖苷酶(>100 U/mg)Sigma公司;4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)Sigma公司;碳酸鈉生工生物工程(上海)有限公司;磷酸氫二鉀;磷酸二氫鉀;α-淀粉酶(500-1500 U/mg)Sigma;馬鈴薯可溶性淀粉廣州化學試劑廠;3,5-二硝基水楊酸(DNS)國藥集團化學試劑有限公司;酒石酸鉀鈉;二甲基亞砜(DMSO)中科瑞泰(北京)生物科技有限公司;磷酸氫二鈉;磷酸二氫鈉;丙三醇;牛血清白蛋白;果糖;疊氮化鈉Sigma公司;ABTS、過硫酸鉀、沒食子酸、NaCl、抗壞血酸、檸檬酸、Na2S2O5、EDTA、乙醇。

CU-420型電熱恒溫水浴鍋上海齊欣科學儀器有限公司;Multlskan FC 酶標儀賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;S20K型pH計梅特勒托利多;UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津);PL303型電子天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司;RF-5301PC熒光分光光度計日本島津公司;SPX-250B-Z生化恒溫培養箱上海博迅實業有限公司醫療設備廠;0.22 μm水系針筒過濾器上海亞興試劑公司。

1.2實驗方法

1.2.1香蕉莖稈汁液乙醇提取物的制備在壓榨出的香蕉莖稈汁液中加入100 mmol/L的NaCl,0.2 mmol/L的抗壞血酸,40 mmol/L的檸檬酸,0.1 mmol/L的Na2S2O5,以及0.2 mmol/L的EDTA-2Na,加入80%的乙醇,體積比為1∶1。然后將香蕉莖稈汁液80 ℃加熱30 min,在25 ℃,10000 r/min條件下離心分離15 min。收集上清液后,旋轉蒸發后得到香蕉莖稈汁液的乙醇提取物,放在4 ℃條件下備用[13]。

1.2.2香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制實驗及動力學

1.2.2.1α-葡萄糖苷酶的抑制實驗向試管中依次加入0.5 mL濃度為0.1 mmol/L pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液,0.1 mL 10 mg/L的α-葡萄糖苷酶酶液(酶活力 1 U/mL),0.5 mL不同濃度的樣液,混勻,37 ℃恒溫水浴15 min后,再加入0.5 mL濃度為2.5 mmol/L的PNPG溶液,混勻后37 ℃恒溫水浴15 min,最后加入1 mL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應,于405 nm處測吸光值,重復3次,取平均值[14]。

α-葡萄糖苷酶活性抑制率計算公式如下:

式中:A空白:不加待測樣品反應后的吸光值；A樣品:加入待測樣品反應后的吸光值；A背景:只加待測樣品反應后的吸光值。

α-葡萄糖苷酶的IC50即半抑制濃度,計算需要測定5個點然后通過曲線擬合得到函數關系式,根據函數關系式計算得出。

1.2.2.2α-葡萄糖苷酶抑制動力學實驗依次向試管中加入0.5 mL濃度為0.1 mmol/L pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液,0.1 mL 10 mg/L的α-葡萄糖苷酶酶液,0.5 mL樣液,混勻,37 ℃恒溫水浴15 min后,再加入0.5 mL濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10 mmol/L的PNPG溶液,同樣混勻后37 ℃恒溫水浴15 min,最后加入1 mL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應,于405 nm處測吸光值,重復3次,取平均值。然后根據Lineweaver-Burk繪圖法,確定化合物的抑制類型和Km值,最后確定香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

1.2.3香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制實驗及動力學

1.2.3.1α-淀粉酶的抑制實驗分別將0.1 mLα-淀粉酶溶液(酶活力5～15 U/mL)和0.5 mL樣品溶液加到試管中,搖勻,37 ℃恒溫水浴15 min,繼續添加0.5 mL 1%淀粉溶液,37 ℃恒溫水浴10 min,取出后再加入0.5 mL DNS溶液,置于沸水中反應15 min,立即用冰水冷卻(終止反應)。蒸餾水稀釋至25 mL,在540 nm下測定OD值,重復3次,取平均值[15]。

α-淀粉酶活性抑制率計算公式如下:

式中:A樣品:加入抑制劑和α-淀粉酶后的吸光值；A樣空:加入抑制劑但不加α-淀粉酶的吸光值；A對照:不加抑制劑但加α-淀粉酶的吸光值；A對空:不加抑制劑也不加α-淀粉酶的吸光值。

α-淀粉酶的IC50即半抑制濃度的計算同α-葡萄糖苷酶的IC50的計算。

1.2.3.2α-淀粉酶抑制動力學實驗參照文獻[15]方法確定最適酶量和初始反應時間后,按照底物濃度對酶作用的影響規律,在一系列不同底物濃度下測定反應初始速率,再通過雙倒數作圖法可求出Km和Vmax。然后要判斷香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制類型(可逆或者不可逆),在固定抑制劑濃度的條件下,以一系列不同濃度的酶進行反應初速率的測定,抑制劑為一組,無抑制劑為另一組,同時進行初速率測定。然后,在A540 nm,以酶濃度對反應速率作圖,根據動力學圖的特征分析,推斷抑制劑對α-淀粉酶的抑制類型屬于可逆或不可逆抑制類型。如果抑制劑對α-淀粉酶的抑制類型屬于可逆抑制類型,再判斷抑制劑對α-淀粉酶的抑制屬于競爭、反競爭或者是非競爭抑制。

1.2.4香蕉莖稈汁液乙醇提取物的抗氧化性用10 mmol/L pH7.4的PBS配制2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液,然后用已配好的過硫酸鉀溶液配制7 mmol/L的ABTS溶液,將其避光放置12～16 h后備用。ABTS儲備液用10 mmol/L pH7.4的PBS稀釋,使其在734 nm條件下吸光值在0.700±0.020范圍內,備用。取4 mL稀釋好的ABTS溶液和40 μL不同濃度的樣品溶液,反應10 min后在734 nm條件下測其吸光值。以沒食子酸作為標準[16]。

(對照組和空白組分別用PBS代替ABTS溶液和樣品溶液)

EC50的計算同樣需要測定5個濃度的清除率然后通過曲線擬合得到函數關系式,根據函數關系式計算得出。

1.2.5香蕉莖稈汁液乙醇提取物在牛血清白蛋白-果糖反應體系下對AGEs抑制作用60 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和果糖(1.5 mol/L)分別用0.2 mol/L的PBS緩沖溶液制備(質量濃度為0.06%疊氮化物,pH7.4)。分別添加200 μL BSA和200 μL果糖溶液于試管中。實驗組加入200 μL香蕉莖稈乙醇提取物、空白組添加去離子水于1.5 mL的試管中充分混勻于37 ℃培養24 h后,用0.22 μm濾膜除菌,置于-20 ℃冷藏備用[17]。培育結束后取反應液,利用熒光分光光度法(激發波長360 nm,發射波長460 nm),然后計算香蕉莖稈乙醇提取物對AGEs的抑制率:

抑制率(%)=(1-實驗組的熒光強度/空白組的熒光強度)×100

1.3數據統計分析

用Excel 2007進行數據的處理及圖表的繪制。

2　結果與分析

2.1香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制實驗及動力學

2.1.1α-葡萄糖苷酶的抑制實驗由圖1所示,香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著其濃度的增加而增加,在2.0 mg/mL以下濃度和抑制率存在線性關系。香蕉莖稈汁液對α-葡萄糖苷酶的IC50為1.51 mg/mL,由此可以看出香蕉莖稈汁液乙醇提取物的抑制活性雖然低于阿卡波糖,但對α-葡萄糖苷酶也具有一定的抑制作用。而香蕉花乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶卻具有較強的抑制活性,粗提物抑制率達88.56%(IC50=343.09 μg/mL),抑制率高于陽性對照阿卡波糖[18]。Pothavorn等[13]對香蕉莖稈汁液的組成進行了分析,結果表明香蕉莖稈汁液中含有大量的多酚和芳香氨基類物質，而多酚類物質大多可溶解于乙醇。因此,香蕉莖稈汁液抑制α-葡萄糖苷酶的活性可能與其含有的多酚類物質有關[13]。

桑葉是臨床上常用的具有降血糖的中藥之一,唐明敏[19]等研究了桑葉不同提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,其中桑葉水提物的活性最高(IC50=0.08 mg/mL),乙醇提取物的半抑制濃度IC50=0.12 mg/mL,均高于陽性對照阿卡波糖(IC50=999.31 μg/mL),由此可以看出香蕉莖稈汁液對α-葡萄糖苷酶雖具有一定的抑制作用,但抑制活性低于目前臨床上常用藥物。

圖1　香蕉莖稈汁液乙醇提取物 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1　Inhibitory effect of ethanol extracts of banana stalk sap on α-glucosidase activity

2.1.2α-葡萄糖苷酶抑制動力學實驗可逆性抑制有三種類型競爭型抑制、非競爭型抑制和反競爭型抑制。抑制類型不同說明酶、底物和抑制劑的結合方式不同。在競爭型抑制中,抑制劑與酶的活性部位結合后,底物就不能再與酶結合;非競爭抑制是底物與酶的活性位點結合后,也可以與抑制劑結合;反競爭型抑制是抑制劑只與酶和底物的復合物結合,而不與游離酶結合。如圖2所示,抑制劑濃度選擇0、1.5、2.5 mg/mL,以1/[S]為橫坐標,1/v為縱坐標的Lineweaver-Burk曲線相交于第一象限,并且隨著抑制劑濃度的增大,v也在增大,所以該抑制類型屬于混合型抑制,底物、酶和抑制劑的結合方式不是單一的一種。張紅城[20]等研究蜂膠乙醇提取物,得出其對α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于非競爭抑制類型,說明底物和抑制劑沒有競爭關系。

圖2　香蕉莖稈汁液乙醇提取物抑制 α-葡萄糖苷酶活性Lineweaver-Burk曲線Fig.2　Lineweaver-Burk plot analysis of the inhibition kinetics of α-glucosidase by ethanol extracts of banana stalk sap

2.2香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制實驗及動力學

2.2.1α-淀粉酶的抑制實驗香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制作用如圖3所示,從圖中可以看出,隨著抑制劑濃度的增大抑制率也在增大;抑制劑濃度為7 mg/mL時,抑制率為18.37%,而當抑制劑濃度為11 mg/mL時,抑制率達到了94.2%。經計算得出,香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-淀粉酶的IC50為8.64 mg/mL。說明香蕉莖稈汁液的乙醇提取物對α-淀粉酶有一定的抑制作用。莫麗春[21]等研究了苦瓜、絞股藍、山藥、蜂膠提取物4種天然產物對α-淀粉酶的抑制作用,結果表明山藥對α-淀粉酶無明顯抑制作用,其余3種天然產物對α-淀粉酶均有抑制作用,對α-淀粉酶半抑制濃度(IC50)分別為30.6、40.7、36.1 mg/mL,對α-淀粉酶的抑制活性均低于香蕉莖稈汁液。

圖3　香蕉莖稈汁液乙醇提取物 對α-淀粉酶的抑制作用Fig.3　Inhibitory effect of ethanol extracts of banana stalk sap on α-amylase activity

2.2.2α-淀粉酶抑制動力學實驗香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制動力學曲線如圖4所示。由于不同的酶與抑制劑的結合方式和特點不同,抑制類型有可逆抑制和不可逆抑制兩種。當反應體系中有可逆性抑制劑存在時,其速率直線通過原點,反之則不通過原點。由此判定香蕉莖稈汁液乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制類型為不可逆性抑制,抑制劑與酶結合后不能通過物理方法除去抑制劑,以至使酶失活。張麗娜[22]等研究了水翁花不同提取物對α-淀粉酶的抑制類型,得出所有提取物對α-淀粉酶的抑制類型都屬于競爭型抑制,說明提取物與底物競爭α-淀粉酶的活性位點。

圖4　香蕉莖稈汁液乙醇提取物 對α-淀粉酶抑制動力學曲線Fig.4　Inhibition kinetics of α-amylase by ethanol extracts of banana stalk sap

2.3香蕉莖稈汁液乙醇提取物對ABTS+·清除能力的測定

沒食子酸和香蕉莖稈汁液對ABTS+·的清除率如圖5所示。清除率與抗氧化劑質量濃度的線性關系是:香蕉莖稈乙醇提取物為y=0.0416x-0.0018,R2=0.9984;沒食子酸為y=1240.1x+1.008,R2=0.9975;而香蕉花各部分的抗氧化活性卻很高,如花、生長點和苞片的 EC50分別為:4.16、2.21、2.08 μg/mL[23]。張丹等[24]研究了檳榔提取物對ABTS+·的清除能力,研究表明檳榔的乙酸乙酯和正丁醇提取物清除ABTS+·的能力都很高,其EC50分別為2.04和7.62 μg/mL。

圖5　沒食子酸(a)和香蕉莖稈汁液乙醇提取物(b) 對ABTS+·清除能力Fig.5　ABTS+· radical scavenging capacities of the gallic acid(a)and ethanol extracts of banana stalk sap(b)

2.4香蕉莖稈汁液乙醇提取物在牛血清白蛋白-果糖反應體系下對AGEs抑制作用

香蕉莖稈汁液乙醇提取物對熒光AGEs的抑制結果如圖6所示。從圖中可以看出,當抑制劑的濃度是2 mg/mL時,抑制率是17.97%;而陽性對照氨基胍在濃度為1.5 mg/mL時的抑制率是63.96%(本實驗室之前的實驗結果)。由此可以看出,香蕉莖稈汁液對AGEs具有一定的抑制作用。Wang[25]等研究發現1.0 mg/mL小麥麥麩提取物在牛血清白蛋白(BSA)-果糖體系中,可以減弱糖化BSA 64%的熒光強度,對該體系產生的AGEs具有較好的抑制效果。Chompoo[26]等研究艷山姜各部分的提取物對AGEs的抑制效果,發現根莖提取物對AGEs有很好的抑制效果,其半抑制濃度低至(164±8.11) μg/mL。其他部分的提取物對AGEs也有很好的抑制作用,均高于陽性對照氨基胍。相比之下,香蕉莖稈汁液對AGEs抑制率較低,可能是由于在香蕉莖稈汁液收集的過程中,汁液中的酚類物質與空氣接觸很快被氧化,失去了抗氧化能力,導致對AGEs的抑制效果不好;也可能由于未對香蕉莖稈汁液乙醇提取物進行分離純化,汁液中存在少量的蛋白質和糖,影響了其抑制活性。

圖6　香蕉莖稈汁液乙醇提取物對AGEs的抑制作用Fig.6　Inhibited effect of ethanol extracts of banana flowers against AGEs

3　結論

香蕉莖稈汁液可抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性,其IC50分別為1.51 mg/mL和8.64 mg/mL、抑制類型為非競爭抑制類型和競爭型抑制。香蕉莖稈汁液對ABTS+·具有一定的清除能力。牛血清白蛋白-果糖反應模型結果表明,香蕉莖稈汁液對AGEs具有一定的抑制作用。因此,香蕉莖稈汁液可作為潛在的糖基化終末產物抑制劑。下一步將重點篩選莖稈汁液的活性組分,明確其多酚類化學組成,進而闡明其抑制AGEs的物質基礎。

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Inhibition to advanced glycation end-products and activity evaluation of sap of banana stem

SHANG Wen-ting1,2,SHENG Zhan-wu2,3,*,GU Man-tun1,2,ZHENG Li-li2,3,AI Bin-ling2,3,YANG jin-song1,*

(1.College of Food Science,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Haikou Experimental Station,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 570102,China;3.Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 570102,China)

To study the inhibition to advanced glycation end-products(AGEs)activity by sap of banana stem,the inhibition of key enzymes in carbohydrate metabolism was evaluated by usingα-glucosidase andα-amylase inhibition model. Inhibitory kinetic parameters were determined by Lineweaver-Burk plot. Meanwhile,the abilities of inhibiting AGEs and removing ABTS+· were also evaluated. The results showed that the median inhibitory concentration(IC50)of sap of banana stem onα-glucosidase was 1.51 mg/mL and the type of inhibition was mix-competitive inhibition. The median inhibitory concentration(IC50)of sap of banana stem onα-amylase was 8.64 mg/mL and the type of inhibition was irreversible inhibition. Through experiment,sap of banana stem had a scavenging activity on removing ABTS+· also had a certain capacity of inhibiting AGEs. The sap of banana stem had a certain inhibitory activity against AGEs.

sap of banana stem;α-glucosidase;α-amylase;advanced glycation end-products

2015-06-18

商文婷(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：廢棄物綜合利用，E-mail：huikudeyuswt@163.com。

盛占武(1981-)，男，碩士，副研究員，研究方向：香蕉廢棄物精深加工，E-mail：shengzhanwu100@163.com。

楊勁松(1966-)，女，本科，教授，研究方向：食品微生物，E-mail：food868@163.com。

國家自然科學基金青年科學基金項目(31201303)；海南省社會發展項目(SF201441); 海南省應用技術研究與開發項目(ZDXM2014104)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)03-0049-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.001