PCI-neo-肝細胞生長因子對脂多糖刺激的大鼠腎小球系膜細胞α-平滑肌肌動蛋白表達的影響

王紅月，張　洋，劉　麗，顧春梅

(吉林大學第一醫院 腎內科，吉林 長春130031)

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PCI-neo-肝細胞生長因子對脂多糖刺激的大鼠腎小球系膜細胞α-平滑肌肌動蛋白表達的影響

王紅月，張洋，劉麗，顧春梅*

(吉林大學第一醫院 腎內科，吉林 長春130031)

目的探討PCI-neo-肝細胞生長因子 (PCI-neo-HGF) 對脂多糖(LPS)刺激的大鼠腎小球系膜細胞(GMCs)的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達是否有抑制作用，以及這種抑制作用是否與對轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達的抑制有關。方法體外培養GMCs并分為5組，(1)Ctrl：對照；(2) C+L：GMCs+ LPS(10 μg/ml)；(3)C+L+P-n:GMCs+LPS(10 μg/ml)+ PCI-neo(2 μg)；(4)C+L+P-n-H2：GMCs+LPS(10 μg/ml) +PCI- neo-HGF(2 μg)；(5)C+L+P-n-H8：GMCs+ LPS(10 μg/ml)+PCI-neo-HGF(8 μg);用RT-PCR的方法測定α-SMA及β-actin mRNA的表達,用Western方法檢測及α-SMA,TGF-β1及β-actin的蛋白表達。結果與Ctrl 組相比，C+L及C+L+P-n 組α-SMA mRNA及蛋白表達增多(P<0.05)，TGF-β1蛋白表達增多(P<0.05)；與C+L相比，C+L+P-n-H2及C+L+P-n-H8組α-SMA mRNA及蛋白的表達均減少(P<0.05)，TGF-β1蛋白的表達減少(P<0.05)。與C+L組比較，加入TGF-β1抑制劑組α-SMA 蛋白表達水平下降(P<0.05)。結論PCI-neo-HGF可抑制LPS刺激的GMCs的α-SMA 的mRNA及蛋白表達，且這種抑制作用可能與其對TGF-β1表達的抑制有關。

肝細胞生長因子；腎小球系膜細胞；α-平滑肌肌動蛋白；轉化生長因子-β1

(ChinJLabDiagn,2016,20:1264)

慢性腎臟病是嚴重危害人類健康的疾病，在它的進展過程中有很多機制參與其發病，如系膜細胞的過度增生、細胞外基質的過度沉積[1]等。肝細胞生長因子(HGF)對腎臟的保護作用有很多研究，目前認為其可通過加速細胞外基質的降解[2]，阻斷小管上皮細胞轉分化及促進細胞增殖[3，4]等實現對腎臟的保護作用。目前研究認為α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是腎小球性損傷中扮演重要角色。關于HGF對腎小球系膜細胞(GMCs)α-SMA表達的影響尚不明確，本研究主要探討HGF對脂多糖(LPS)刺激的大鼠GMC的α-SMA的表達是否有抑制作用，以及這種抑制作用是否與對轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達的抑制有關。

1　材料與方法

1．1大鼠GMC的培養及質粒轉染將對數生長期的大鼠腎小球系膜細胞進行傳代培養，第4代用于實驗，質粒采用脂質體轉染法，于轉染后48 h收集細胞備用。LPS在轉染之前6小時加入。TGF-β1抑制劑在加入脂多糖后4小時加入。

1.2分組將傳代培養的GMC分為如下5組： (1)Ctrl：對照；(2) C+L：GMCs+ LPS(10 μg/ml)；(3)C+L+P-n:GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo(2 μg)；(4)C+L+P-n-H2：GMCs+ LPS(10 μg/ml) +PCI-neo-HGF (2 μg)；(5)C+L+P-n-H8：GMCs+ LPS(10 μg/ml)+ PCI-neo-HGF(8 μg)。加入TGF-β1抑制劑后分2組：(1)C+L：GMCs+LPS(10 μg/ml)；(2)C+L+i-T-β1：GMCs+LPS (10 μg/ml)+ TGF-β1抑制劑(8 μg)。

1.3α-SMA mRNA的表達

采用RT-PCR的方法檢測，首先提取RNA，合成cDNA，計算RNA濃度。PCR擴增α-SMA基因，β-actin為內參。PCR特異性引物及擴增條件見表1。PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳后，用Phoretix ID凝膠圖像分析軟件測定電泳條帶的吸收度，用內參校準。

表1　PCR特異性引物及擴增條件

1.4TGF-β1及α-SMA蛋白水平

用Western印記法檢測。轉染后48 h的細胞加入細胞裂解緩沖液，離心，提取總蛋白，測定蛋白含量電泳、移膜，封閉。加入一抗、二抗室溫孵育1 h。晾干拍照。應用ECL化學發光試劑在X線膠片上曝光、顯影和定影。測定TGF-β1及α-SMA蛋白表達條帶的灰度值，用β-actin作為內參，計算比值。

2　結果

2.1各組 GMC的α-SMA mRNA及蛋白的表達

48 h時PCI-neo-HGF對LPS刺激的GMC的α-SMA 的mRNA表達及半定量分析(圖1，A、B),蛋白表達及半定量分析(圖1，C、D)。與Ctrl 組相比，C+L及C+L+P-n 組α-SMA mRNA及蛋白表達明顯增多(P<0.05)，C+L及C+L+P-n兩組無統計學差異(P>0.05)，說明LPS可刺激GMC α-SMA mRNA及蛋白的表達，而PCI-neo對α-SMA的表達無影響；與C+L相比，C+L+P-n-H2及C+L+P-n-H8組α-SMA mRNA及蛋白的表達均減少，說明PCI-neo-HGF對LPS刺激的GMC的α-SMA的表達有抑制作用，且隨著劑量的增加抑制作用增強。

2.2各組 GMC的TGF-β1蛋白的表達

48 h時PCI-neo-HGF對LPS刺激的GMC的TGF-β1蛋白表達及半定量分析(圖2)。與Ctrl 組相比，C+L及C+L+P-n 組TGF-β1蛋白表達明顯增多(P<0.05)，C+L及C+L+P-n兩組無統計學差異(P>0.05)，說明LPS可刺激GMC TGF-β1蛋白的表達，而PCI-neo對TGF-β1的表達無影響；與C+L相比，C+L+P-n-H2及C+L+P-n-H8組TGF-β1蛋白的表達均減少，說明PCI-neo-HGF對LPS刺激的GMC的TGF-β1的蛋白表達有抑制作用，且隨著劑量的增加抑制作用增強。與PCI-neo-HGF對α-SMA蛋白表達抑制作用趨勢一致。

注：A)、B) 各組α-SMA mRNA的表達(RT-PCR);C)、D)各組α-SMA蛋白的表達(Western blot)。 與Ctrl組比較，*P<0.05，與C+L組比較，#P<0.05。

圖1LPS刺激后各組α-SMA mRNA及蛋白表達

注： 與Ctrl組比較，*P<0.05，與C+L組比較，#P<0.05。

2.3TGF-β1抑制劑對LPS 刺激的GMC α-SMA 表達的影響

在48 h時，TGF-β1抑制劑對LPS 刺激的GMC α-SMA 蛋白表達及半定量分析(圖3)。與C+L組比較，加入TGF-β1抑制劑組α-SMA 蛋白表達水平明顯下降。由此得出，TGF-β1抑制劑能抑制LPS刺激的GCM α-SMA的表達。也就是說，LPS誘導后GMC α-SMA表達的升高與TGF-β1表達升高有關。

注：與C+L 組比較 #P<0.05。

3　討論

LPS可刺激腎小球系膜細胞的增生，且研究認為PCI-neo-HGF可抑制LPS刺激的腎小球系膜細胞的增生，而且這用抑制作用與對TGF-β1的抑制有關[5]。

本研究結果顯示，LPS可刺激GMC的α-SMA 的mRNA及蛋白表達，而PCI-neo-HGF可抑制LPS刺激的GMC的α-SMA 的mRNA及蛋白表達，且隨著劑量的增加抑制作用增強。α-SMA誘導的系膜細胞活化是基質沉積、腎小球硬化性損傷的重要環節[6]，由此得出HGF可通過對腎小球系膜細胞α-SMA表達的抑制而實現對腎臟的保護。我們研究也顯示，PCI-neo-HGF可抑制脂多糖刺激的腎小球系膜細胞TGF-β1蛋白的表達。進一步研究HGF對α-SMA表達的抑制是否與其抑制TGF-β1的表達有關，我們在LPS刺激的GMC中加入TGF-β1抑制劑，觀察到α-SMA的表達明顯下降，由此我們得出，HGF對LPS刺激的腎小球系膜細胞α-SMA的抑制作用與其對TGF-β1表達的抑制有關。

[1]Grupp C,Troche I,Klass C,et al.A novel model to study renal myofibroblast formationin vitro[J].Kidney Int,2001,59(2):543.

[2]Dai C,Liu Y.Hepatocyte growth factor antagonizes the profibrotic action of TGF-beta 1 in mesangial cells by stabilizing Smad transcriptional corepressor TGIF[J].J Am SocNephrol,2004,15(6):1402.

[3]Li Y,Yang J,Dai C,et al.Role for integrin-linked kinase inmediating tubular epithelial tomesenchymal transition and renal intersttial fibrogenesis[J].J Clin Invest,2003,112(4):503.

[4]Weidong Wang,Chunling Li,et al.Role of AQP1 in endotoxemia-induced acute kidney injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,294:1473.

[5]王紅月，顧春梅，崔明姬.PCI-neo-肝細胞生長因子對大鼠腎小球系膜細胞增生及對轉化生長因子β1表達的影響[J].中華腎臟病雜志，2011，27(5)：376.

[6]Chunsun Dai,Junwei Yang,Sheldon Bastacky,et al.Intravenous Administration of Hephtocyte Growth Factor Gene Ameliorates Diabetic Nephropathy in Mice[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(10):2637.

The Effects of PCI-neo- HGF on the express of α-SMA in rat glomenrulus mesangial cells stimulated by LPS

WANG Hong-yue，ZHANG Yang，LIU Li，et al.

(DepartmentofNephrology,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130031，China)

ObjectiveTo inquire whether PCI-neo-hepatocyte growth factor (HGF) could inhabit the express of α-smooth muscle actin (α-SMA) in rat glomenrulus mesangial cells (GMCs) stimulated by lipopolysaccharide (LPS),and whether this effect was associated with transforming growth factor-β1 (TGF-β1).MethodsGMCs were divided into the following groups:Ctrl:control;C+L:GMCs+ LPS(10 μg/ml);C+L+P-n:GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo(2 μg);C+L+P-n-H2：GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo-HGF(2 μg);C+L+P-n-H8：GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo-HGF(8 μg).α-SMA and β-actin mRNA expressions were detected by RT-PCR.The protein expressions of α-SMA,β-actin and TGF-β1 were detected by Western.ResultsCompared with Ctrl group,the mRNA and protein expresses of α-SMA increased (P<0.05),and the protein express of TGF-β1 increased(P<0.05)in C+L group and C+L+P-n group.Compared with C+L group,the mRNA and protein expresses of α-SMA increased (P<0.05),and the protein express of TGF-β1 increased(P<0.05)in C+L+P-n-H2 group and C+L+P-n-H8 group.Compared with C+L group,the express of α-SMA protein decreased in adding inhibition of TGF-β1 group(P<0.05).ConclusionPCI-neo-HGF could inhibit mRNA and protein expresses of α-SMA in rat GMCs stimulated by LPS,and this effect maybe was associated with inhibiting TGF-β1.

Hepatocyte growth factor;Glomenrulus mesangial cells; α- smooth muscle actin;transforming growth factor-β1

吉林省衛生廳基金(2009ZC041)

1007-4287(2016)08-1264-04

Q51

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2015-12-21)