液相色譜質譜聯用技術的膠質瘤代謝譜特征研究

蘭春光,李　淼,張海鳳,勾金瑞,曹靖惠

(吉林大學中日聯誼醫院 神經外一科，吉林 長春130033)

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液相色譜質譜聯用技術的膠質瘤代謝譜特征研究

蘭春光,李淼,張海鳳,勾金瑞,曹靖惠*

(吉林大學中日聯誼醫院 神經外一科，吉林 長春130033)

腦腫瘤患者一般具有非常低的存活率和高的復發率,成年病人一旦診斷出患有原發惡性腦腫瘤，那么其5 年存活率不足 30%[1-4]。據臨床統計資料顯示,在所有原發腦腫瘤中,占大部分比例的是膠質瘤(如星形細胞瘤和膠質母細胞瘤)病例，約占 45%,其發病率大約在十萬分之五到十萬分之十[5].并且因其部位的特殊性，造成診斷困難，易復發而且難以治愈。因此,及早發現和準確診斷腫瘤對于確定腫瘤正確的治療方案至關重要。

現今,腦腫瘤的臨床診斷主要是依靠腫瘤組織形態學的病理檢查以及X-射線計算機斷層成像術(CT)[6]、磁共振成像(MRI)[7,8]和正電子發射成像(PET)[9,10]等一些現代診斷技術。這寫檢查是目前確定腫瘤病人正確治療方案最基本的技術手段，在腦腫瘤的臨床診斷和研究中已得到越來越廣泛的應用。但是，這些技術只能作為病理診斷的輔助手段，只能提供腫瘤大小、生長方位等一些信息的確認和評價，因此，尋找新的診斷膠質瘤的方法是目前的重點。

代謝組學(metabonomics)是研究生物體系內源性代謝物質受刺激或擾動后其種類、數量及變化規律的科學，它研究的是生物整體、系統或器官的內源性代謝物質受到內在或外在因素影響時所產生變化規律以及代謝途徑。代謝組學作為一門新興熱門的“組學”技術，是系統生物學的一個重要分支，已在全球范圍內展示出強勁的發展勢頭。目前，代謝組學已經有了廣泛的應用，如在發現生物標記物[10]、疾病早期診斷[11]、發病機制的研究[12]、及藥理藥效的評價等方面[13]，并且在惡性腫瘤[14,15]、心臟病[16,17]、糖尿病[18,19]等重大疾病研究當中已經很成熟了。

本研究通過應用高效液相色譜質譜聯用技術對25例神經膠質瘤患者以及25例健康志愿者的尿液進行代謝組學分析，以找到可以對神經膠質瘤進行診斷的潛在生物標志物。

1　材料與方法

1.1樣本來源及處理

本研究中應用的尿液樣本來自吉林大學2014年8月-2015年2月住院的25例初次診斷為膠質瘤并未經任何治療的患者以及25例健康志愿者，研究對象的年齡、性別基本特征如表1，并未發現兩組之間年齡與性別存在差異。所有受試者均在充分告知研究詳情后簽署知情同意書。所有膠質瘤患者均有病理明確診斷為膠質瘤。所有受試者均于空腹清晨留取尿液樣本，尿樣采集后即以3 500 r/min離心2 min，去掉雜質后于-80℃下冰凍保存備用。將樣本從-80℃冰箱中取出，室溫下溶解。先由所有樣本(包括實驗組和對照組)中各取50 μl混合在一起，配成質量控制組(Quality Control，QC)。每個樣本(包括實驗組、對照組和QC組)各取100 μl，然后各加入乙腈500 μl，渦旋混勻后，4℃、14 000 r/min離心5 min，取上清液供 LC-MS 分析。

1.2材料

表1　研究對象年齡、性別基本特征

乙腈(西格瑪奧德里奇上海有限公司)甲酸(西格瑪奧德里奇上海有限公司)質譜校機液(美國ABSciex公司)超純水(由Milli-Q超純水機制備)HPLC色譜柱(美國Agilent公司)Agilent快速分離液相色譜系統(美國Agilent公司)ABSciexTripleTOF5600質譜儀(美國ABSciex公司)LD5-2A低速離心機(北京醫用離心機廠)LR16-A高速冰凍離心機(北京雷勃爾離心機有限公司)KQ-250DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)QL-901微型漩渦混合器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)

1.3分析條件

1.3.1色譜條件

色譜柱： Agilent Eclipse Plus C18 (2.1×150 mm，3.5 μm，Agilent，USA)。柱溫：45℃。進樣量：20 μl。實驗中流動相為：正離子：流動相A：水+0.1%甲酸；流動相B：乙腈+0.1%甲酸；負離子：流動相A：水；流動相B：乙腈；實驗前將流動相置于KQ-250DE數控超聲波清洗器中超聲，排凈氣體，以防影響實驗結果。

表2　梯度洗脫程序

1.3.2質譜條件用電噴霧離子化正、負離子采集模式(ESI+、ESI-)，毛細管電噴霧電壓:3.5 kV;霧化氣(NZ) :30 psi;干燥氣(NZ):流速10.0 L/min:溫度350 ℃。

2　結果

2.1主成分分析 PCA

本實驗通過LC-MS得到尿液樣本的數據，將其結果導入MarkerView商業軟件。實驗中首先對數據采用了主成分分析(PCA)進行比較，觀察兩組樣本是否存在差異。其得分圖(Score plot)如圖1和2所示，圖中的每一個點代表一個樣本，可以看到樣本分成3個部分，黑色的代表健康人的樣本，藍色的代表膠質瘤患者的樣本紅色的代表質量監控組。從正負離子模式下的得分圖上看，癌癥組與正常組的分布均能較好的分離開來，表示兩組之間的代謝存在明顯的差異，且組內差異較小。

(■) 膠質瘤患者，(*)健康人，(?)質量監控組

(■)膠質瘤患者，(*)健康人，(?)質量監控組

2.2t檢驗

再次將處理后的數據使用MarkerView商業軟件對膠質瘤患者和健康對照進行t檢驗分析，得到正、負離子模式下尿液樣本中有差異的代謝產物。在正離子模式下獲得 54個存在顯著差異(P<0.05)的代謝物；在負離子模式下獲得90個存在顯著性差異(P<0.05)的代謝物。

2.3聚類分析

將t檢驗結果中P<0.05的代謝物進行聚類分析，結果如圖3所示。圖中橫向代表各個樣本，C為健康人組樣本，T為膠質瘤組樣本，縱向表示的是具有差異的(P<0.05)代謝物的質核比。從圖中可以看到，這些差異代謝物具有良好的將膠質瘤組與健康人組區分開的能力。

圖3尿液樣本差異代謝物的聚類分析結果

2.4偏最小二乘判別分析PLS-DA

為了進一步尋找與膠質瘤高度相關的差異代謝產物，本實驗又使用simca_p軟件應用有監督模式識別方法PLS-DA進行建模，對P值小于0.05的代謝物進行進一步分析，得到了很高的模型解釋率(R2Ycum=0.894)和判別率(Q2Ycum=0.820)，得到其得分圖和VIP圖，圖4為PLS-DA得分圖，黑色的Class 1代表膠質瘤組，紅色的Class 2代表健康人組，從圖中可以看到，膠質瘤組與健康人組很好的區分開，為了從該模型中尋找與膠質瘤高度相關的差異代謝產物，本實驗得到該模型的VIP圖，根據VIP值的結果，選取VIP>1的代謝產物共69種，為高度相關的差異代謝產物進行結構鑒定，正離子模式下共16種，負離子模式下共53種。

A：得分圖，黑色的Class 1代表膠質瘤組，紅色的Class 2代表健康人組；B：各代謝物重要性圖(VIP)

圖4尿液樣本PLS-DA結果

2.5代謝物結構鑒定

將找到的生物標志物導入HMDB數據庫，進行結構鑒定。在HMDB數據庫中找到正離子模式下的生物標志物8種，負離子模式下的生物標志物11種。具體如表3所示。

3　討論

眾所周知,由于惡性腦腫瘤病人存活率較低,使得腫瘤的早發現對于確定腫瘤最佳治療方案和預后有著極其重要的作用。為了尋找對人體創傷小，靈敏度高、特異性好的檢查方法，本研究采用液相色譜質譜聯用的代謝組學分析技術，對膠質瘤患者與健康人的尿液為進行分析，將得到的數據進行主成份分析以及聚類分析，結果顯示可以很好的對兩組進行區分，說明兩組的樣本具有很好的差異性，經過進一步的偏最小二乘判別分析以及結構鑒定，最終找到了19種具有明顯差異的代謝產物，其中大多數為氨基酸類物質，其余的則為myo-Inositol ， lactate等已報導與腫瘤代謝相關的代謝產物。

表3　代謝物結構鑒定

從結果中可以看出，膠質瘤患者與健康人的代謝模式差別主要反映在氨基酸代謝及能量代謝上。有人對腦腫瘤患者的腫瘤組織代謝情況進行磁共振分析，發現丙氨酸、甘氨酸等濃度與腫瘤的惡性程度有關[20-22]。

本研究中發現丙氨酸等代謝產物的濃度在膠質瘤患者的尿液中的濃度明顯高于健康人，與前人研究結果相似。本研究中還發現牛磺酸代謝產物，牛磺酸具有抗腫瘤作用，有研究表明[23]乳腺癌患者血清中牛磺酸的濃度明顯降低，與本研究結果相似，提示牛磺酸濃度的降低可能與腫瘤的抗凋亡能力增強有關，因此牛磺酸的降低可能為患有惡性腫瘤的標志，但也有研究表明，膀胱癌患者尿液中牛磺酸的水平明顯升高[24]。本研究結果中發現檸檬酸在膠質瘤患者的尿液中含量比健康人的多，我們推測膠質瘤患者腫瘤細胞的有氧代謝受阻，考慮與腫瘤細胞處于缺氧狀態有關。本研究還發現亮氨酸、纈氨酸、醋酸鹽等物質的改變，這些物質沒有發現與腫瘤發生的相關報導與研究，可能為膠質瘤特異的改變。本研究中偏最小二乘判別分析結果中VIP值大于1的共有69種，最后鑒別出結構的代謝產物只有19種，基于此種情況，考慮HMDB數據庫還需進一步完善。

綜上，本研究中找到的代謝產物具有區分膠質瘤與健康人的能力，可能為潛在的標志物對膠質瘤進行診斷，但由于樣本量較少，為了進一步驗證，還需要進行大樣本的研究。

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