糖尿病小鼠合并結核菌感染后TNF-α表達及腸黏膜病理形態學觀察

吳　華

(唐山市第四醫院(結核病醫院) 內四病區，河北 唐山063000)

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糖尿病小鼠合并結核菌感染后TNF-α表達及腸黏膜病理形態學觀察

吳華

(唐山市第四醫院(結核病醫院) 內四病區，河北 唐山063000)

糖尿病患者是結核病的高度易感人群[1,2]，與糖尿病免疫功能紊亂等病理機制密切相關[3]。糖尿病患者合并結核病后將導致糖尿病病情迅速加重。到目前為止對糖尿病病因機制的研究較深入，其中小腸黏膜屏障受損是導致糖尿病發生、發展的重要因素之一[4]，進一步研究發現：小腸黏膜屏障受損與多種細胞因子作用相關，TNF-α在該過程中起核心作用[5]。對結核桿菌感染后機體免疫調節功能相關研究證實，單一結核桿菌感染后機體TNF可出現表達異常[6,7]。鑒于以上結果，本研究將通過動物實驗證實糖尿病合并結核菌感染后是否出現TNF-α表達紊亂及是否存在與TNF-α相關的腸黏膜病理形態學改變，為糖尿病合并結核病時，結核病可能出現的通過TNF-α相關途徑影響腸黏膜屏障改變病理過程及臨床治療研究提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物健康清潔級ICR小鼠60只(18-22g，雌雄各半),由華北煤炭醫學院動物中心提供。

1.1.2藥物及檢測試劑鏈尿佐菌素(streptoxolocin，STZ)，弗氏完全佐劑(CFA)；Sigma公司；TNF-α，北京華英生物技術研究所提供；結核菌：我院檢測科分離的INH耐藥菌株。

1.2方法

1.2.1糖尿病模型制備A、B組小鼠第1天腹腔注射0.5mlCFA，次日按25mg·kg-1腹腔內注射STZ[8]溶液，每周1次，連續3周后A組進行相關指標檢測及觀察。此模型屬遲發型糖尿病模型，有免疫學的改變，更接近人類IDDM的發生發展變化。

1.2.2糖尿病感染結核菌模型糖尿病模型建立2周后，將臨床分離的INH耐藥株經B組小鼠皮下注射感染0.01MG，(2.5×104CFU)，合并結核感染模型建立后第8周進行相關指標檢測及觀察。

1.2.3TNF-α檢測于清潔環境，手術房間經紫外線消毒，參加手術人員穿無菌手術衣，佩帶一次性口罩、帽子及無菌一次性手套，所用手術器械均經高溫、高壓滅菌，接觸血樣物品均使用一次性用品。C組研究開始、A、B組模型制作完成并完全符合各組標準后第3和第8周，在水合氯醛麻醉下，取腹部縱切口打開腹腔，分離出下腔靜脈，分別用無菌注射器抽取血液進行TNF-α檢測。

1.2.4小腸病理標本的采集各組小鼠于抽血成功后繼續切取回盲部小腸組織5cm，將采集小腸沿腸系膜緣剖開,以細圓玻璃棒輕柔展平，把小腸組織的長軸兩端用細小訂書釘固定于剪好的A4打印紙片上，用PBS緩沖液洗去腸壁上殘存的糞便、污垢。將其置入4%中性甲醛溶液中固定48小時以上(中間在固定標本4小時后更換甲醛液一次),然后取出標本,嚴格垂直定向石蠟包埋,切片,每只動物標本均連續切片10張,切片厚度為4μm，留作病理實驗標本。HE染色病理學觀察。采用HPIAS-1000彩色病理圖像分析系統觀測HE染色切片，隨機全盲觀測。在光鏡下(100倍)每個時相隨機計數為20個視野。腸損傷指數的計測根據Chiu等報告的腸黏膜損害指數(IntestinalmucosalesionIndex，IMLI)計分的標準判定[9]。

1.3統計方法

2　實驗結果

2.1小腸黏膜

2.1.1小腸黏膜HE染色病理形態學觀察

A組小鼠小腸黏膜的絨毛呈指狀突起，絨毛較長，其高度是隱窩的數倍，其間有散在少量淋巴細胞浸潤，表面覆蓋以單層柱狀上皮細胞，其腸腔面可見濃集的刷狀緣。絨毛中軸的固有層結締組織內可見1-2條縱形的毛細淋巴管。(圖1)

B組小腸黏膜絨毛稀疏水腫，變粗，變厚，形態規則整齊，絨毛頂端上皮下可見囊狀間隙，伴有毛細血管充血，杯狀細胞部分呈圓形，上皮細胞排列整齊，形態規則。(圖2)

C組正常小鼠小腸黏膜。(圖3)

圖1A組小腸黏膜(×40)圖2B組小腸黏膜(×40)圖3C組小腸黏膜(×40)

2.1.2小腸黏膜IMLI比較

顯示A、B兩組差異顯著(t=4.87；P<0.01)。(表1)

2.2血清TNF-α檢測結果比較

TNF-α指標A、B兩組比較(t=2.88；P<0.01)；B、C兩組比較(t=5.98；P<0.01)；A、C兩組比較(t=2.99；P<0.01)。(表1)

3　討論

糖尿病腸黏膜屏障損傷最重要原因之一表現為腸黏膜支持系統異常，包括腸道微生態平衡失調、腸道血液供應不足、腸動力障礙和腸免疫系統受損等多種因素[10]。在上述單一或多因素作用下，小腸黏膜通透性增加，吸收形態學改變[11]，表現為小腸絨毛裂隙增多加深，上皮細胞微皺折，絨毛中軸篩狀孔等改變，使葡萄糖攝入增加，導致糖耐量降低，體重、脂肪增加等一系列改變。在這種黏膜變化過程中TNF-α發揮重要作用：研究證實糖尿病是一種持續低水平的慢性炎癥反應[12-14]，炎性過程中細胞因子TNF-α升高[15]，作為一種慢性代謝性疾病，持續升高的TNF作為炎癥指標直接參與腸黏膜損傷的病理過程[16]，包括激活中性粒細胞，釋放大量活性氧與彈性蛋白酶，刺激交感-腎上腺髓質系統使機體內兒茶酚胺分泌增加，促進白三烯(LT)、血栓素A2(TXA2)、血小板激活因子(PAF)等多種血管活性物質釋放；誘導大量NO生成，此外，TNF-α可以增加線粒體膜的通透性，減弱線粒體的呼吸作用，減少線粒體細胞色素，導致細胞程序性死亡;TNF-α引起的過多NO通過蛋白的氧化、硝化、S-亞硝化、c-GMP激活和細胞能量耗竭等機制造成腸黏膜屏障功能失調。最終造成腸黏膜血管、細胞受損、微循環障礙、腸黏膜缺血缺氧低灌流等情況,導致小腸黏膜病理形態學改變，屏障功能受損。本研究中糖尿病組TNF-α與與對照組比較有顯著意義的升高，同時出現小腸黏膜病理形態學改變(圖1)，與上述病理過程研究相符。而在共病組中TNF-α較糖尿病組出現更顯著升高，小腸黏膜病理形態學則表現更嚴重的改變(圖2)，這一結果與結核感染后機體發生TNF-α變化相關：結核感染后機體通過免疫相關基因等多種機制使TNF-α表達增加[17-18]，在糖尿病時糖、脂、蛋白及免疫功能紊亂，營養不良、酸性環境、免疫調節紊亂等背景下，結核菌生長繁殖加快，病情進展迅速，進而導致TNF-α呈持續過多性病理性升高[19]，在糖尿病本身TNF-α升高致腸黏膜損傷基礎上進一步了強化該病理機制過程，從而表現出本研究中進一步加重的病理形態學損傷。

表1　ABC組腸損傷指數及TNF-α結果分析

注：IMLI指標AB兩組比較*P<0.01。TNF-α指標AB兩組比較*P<0.01；BC兩組比較▲P<0.01；AC兩組比較▼P<0.01。

研究結果顯示，在整個研究過程中糖尿病組與合并組TNF-α、小腸黏膜損傷均呈顯著正相關。糖尿病小鼠感染結核后顯著升高的TNF-α加重本已存在的小腸黏膜屏障損傷，加劇糖尿病病理過程。除此之外，感染結核后進一步升高的TNF-α還通過多途徑抑制胰島素作用及產生胰島素抵抗加劇糖尿病癥狀[20]，有關這一機制將在今后研究中繼續探討。這一結論完善了結核通過TNF-α損傷腸黏膜屏障機制加重糖尿病的病理過程，由于小鼠與人體存在腸黏膜結構、免疫功能等方面的差異，今后在本研究基礎上將進行進一步糖尿病合并結核感染的人體活組織檢查，為臨床治療提供更可靠的依據。

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1007-4287(2016)08-1254-03

吳華，女，41歲，主治醫師，研究方向：結核內科。

2015-09-12)