BAS-TRFIA法檢測(cè)抗環(huán)瓜氨酸肽抗體方法學(xué)的建立

李　梅，葉　燕，胡志剛，張　健，俞　蕾，陳國(guó)千

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫214023)

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BAS-TRFIA法檢測(cè)抗環(huán)瓜氨酸肽抗體方法學(xué)的建立

李梅*，葉燕*，胡志剛，張健，俞蕾，陳國(guó)千

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫214023)

目的利用生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)建立一種可快速、靈敏地定量檢測(cè)患者血清中抗環(huán)瓜氨酸肽(anticycliccitrullinatedpeptide,CCP)抗體的時(shí)間分辨熒光免疫分析法(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)。方法將鏈霉親和素同銪標(biāo)記二乙烯三胺五乙酸酐結(jié)合制備銪標(biāo)記鏈霉親和素衍生物；生物素同兔抗人IgG抗體結(jié)合制備生物素化IgG抗體，后者在免疫檢測(cè)系統(tǒng)中可聯(lián)結(jié)銪標(biāo)記親和素和抗CCP抗體從而形成復(fù)合物。最后通過(guò)測(cè)量Eu3+-鏈霉親和素在615nm的熒光值計(jì)算血清抗CCP抗體水平。結(jié)果該方法具有更寬的線性范圍，其線性范圍為0.58-9463U/ml，而應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)線性范圍只有18.48-591.4U/ml。此外，該方法的抗CCP抗體檢測(cè)限可達(dá)0.5U/mL?；厥章蕿?6.45-104.63%。用BAS-TRFIA和ELISA法測(cè)得的值具有很好的相關(guān)性(R2=0.892 7)。結(jié)論本研究數(shù)據(jù)表明我們的建立的BAS-TRFIA法在測(cè)定抗CCP抗體上較傳統(tǒng)ELISA試劑盒有很大改進(jìn)，為RA的診斷和治療提供了一個(gè)更為理想的免疫方法學(xué)選擇。

環(huán)瓜氨酸肽；類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；時(shí)間分辨熒光免疫分析

(Chin J Lab Diagn,2016,20:1250)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis,RA)是一種炎癥性自身免疫性疾病，全球患病率為0.3-1%。RA可導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)侵蝕，治療不及時(shí)情況下可致殘并導(dǎo)致患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。因此，早期診斷對(duì)RA患者的預(yù)后十分關(guān)鍵。早期，一系列瓜氨酸相關(guān)自身抗體包括抗核周因子、抗角蛋白抗體等不斷被發(fā)現(xiàn)，這些抗體被認(rèn)為對(duì)早期的RA診斷具有較好的特異性[2]。1998年Schellekens等首次突破性證實(shí)含瓜氨酸的肽序列是RA特異的抗中間絲蛋白(filaggrin)相關(guān)蛋白抗體識(shí)別表位的必需組成。2000年Schellekens等報(bào)道將一條由19個(gè)氨基酸殘基組成的瓜氨酸肽鏈中的兩個(gè)絲氨酸替換為半胱氨酸，形成與β-轉(zhuǎn)角具有相似結(jié)構(gòu)的二硫鍵，合成CCP作為抗原用于ELISA法檢測(cè)抗CCP抗體[3]?？笴CP抗體可以檢測(cè)出高達(dá)80%的RA患者，特異性相當(dāng)高，尤其對(duì)鑒別侵蝕性RA十分有用[4]。

TRFIA是一種非放射性免疫分析方法，由于該方法所采用的鑭系元素具獨(dú)特的熒光性質(zhì)以及時(shí)間分辨測(cè)量模式，它比其他傳統(tǒng)熒光免疫法具更高的靈敏度[5]?；赥RFIA技術(shù)的生物分析方法已對(duì)臨床常規(guī)和研究領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響[6]。

目前，Eu3+標(biāo)記的鏈霉親和素可作為一個(gè)很好的通用的間接標(biāo)記物和時(shí)間分辨熒光系統(tǒng)相結(jié)合從而進(jìn)一步放大信號(hào)且具有非特異性較低的特點(diǎn)。四聚體結(jié)構(gòu)的鏈霉親和素有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，從而可用于放大信號(hào)[7]。此外，銪元素作為通用熒光標(biāo)記可用于大量生物活性物質(zhì)的高通量篩查[8，9]。

本文中我們制備了Eu3+-鏈霉親和素的銪螯合物，并將其作為結(jié)合生物素表面免疫基序的一個(gè)信號(hào)生成器。這是一種新的、快速的基于鏈霉親和素-生物素放大技術(shù)的抗CCP抗體的BAS-TRFIA測(cè)定法。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑芬蘭AutoDELFIA1235全自動(dòng)TRFIA檢測(cè)儀、Eu3+標(biāo)記的試劑盒以及Eu3+標(biāo)記的增強(qiáng)液，芬蘭Wallac公司產(chǎn)品；96孔聚苯乙烯板和重組CCP抗原，德國(guó)AESKU產(chǎn)品；單克隆兔抗人IgM抗體、二乙二胺四乙酸(DTTA)，Sigma產(chǎn)品；牛血清白蛋白，衛(wèi)生部上海生物制品研究所產(chǎn)品；SephadexG25，Pharmacia產(chǎn)品；濃縮洗滌液和增強(qiáng)液由江蘇核醫(yī)學(xué)研究所提供；其他試劑均為分析純級(jí)試劑。

1.2ELISA試劑盒和抗CCP抗體標(biāo)準(zhǔn)品制備抗CCP抗體IgGELISA商品試劑盒分別為AESKU，Dr.Fenning和ORGENTEC產(chǎn)品，抗CCP抗體參考品來(lái)自AESKU。

1.3固相抗原制備

將重組CCP抗原用50mmoL/LNa2CO3-NaHCO3pH9.6緩沖稀釋制備成包被液，加至聚苯乙烯微孔板上100μl/孔，然后4℃孵育過(guò)夜。棄去包被液，沖洗3次后加入250μl含3g/LBSA的磷酸鹽緩沖液封閉未結(jié)合位點(diǎn)，4℃孵育過(guò)夜。棄去封閉液，將板條真空干燥，密封后置-20℃冷凍保存。

1.4生物素化抗人IgG抗體的制備

取1mgN-羥基琥珀酰亞胺生物素(BNHS)加至0.5mg的兔抗人IgG的pH7.2 0.05mol/LPBS緩沖液中，37℃反應(yīng) 1h，然后用PBS透析24h，分裝，使用前-20℃冷凍保存。

1.5Eu3+標(biāo)記鏈霉親和素的制備

銪標(biāo)記鏈霉親和素參照Eu3+標(biāo)記盒說(shuō)明書(shū)操作。將1mg克鏈霉親和素加載在PD10柱上，洗脫液為pH8.5 50mmoL/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液(含0.155moL/LNaCl)。然后將鏈霉親和素混至0.2mgEu3+-二乙烯三胺五乙酸酐(DTPAA)，30℃條件下劇烈攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)液經(jīng)用pH7.8 80mmoL/LTris-HCl緩沖液平衡的SepharoseCL-6B柱(1×40cm)層析，分光光度儀280nm吸收波長(zhǎng)檢測(cè)下收集蛋白峰。純化后，加等量AR甘油，分裝，-20℃保存。

1.6抗CCP抗體檢測(cè)

檢測(cè)采用間接ELISA法。在包被了CCP抗原的微孔板內(nèi)加100μl/孔經(jīng)反應(yīng)緩沖液稀釋的血清或參考標(biāo)準(zhǔn)品，25℃反應(yīng)震蕩孵育30min。用洗滌液沖洗板條4次，然后加生物素化兔抗人IgG抗體100μl/孔，25℃震蕩孵育30min。沖洗板條4次，然后加100μl/孔經(jīng)緩沖液稀釋的Eu3+標(biāo)記的鏈霉親和素，震蕩孵育15min。洗滌6次后，加增強(qiáng)溶液100μl/孔，震蕩5min。用AutoDELFIA1235測(cè)量Eu3+熒光強(qiáng)度(CPS)。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中抗CCP抗體的含量。

1.7方法學(xué)考核

①精密度檢測(cè)：將分裝儲(chǔ)存在-20℃的低、中、高3份混合血清樣品，混合血樣，隨樣品測(cè)定并分別計(jì)算混合血清樣品的變異系數(shù)(CV)值。②線性范圍試驗(yàn)：取抗CCP抗體濃度最高的患者血清進(jìn)行倍比稀釋后，分別用本文建立的BAS-TRFIA和ELISA兩種方法進(jìn)行檢測(cè)。以稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo)，得到線性稀釋濃度曲線圖。③靈敏度測(cè)試：測(cè)定20孔零點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品，±2s為其最小測(cè)定值，即其靈敏度。④臨床應(yīng)用：收集52例健康獻(xiàn)血者血清標(biāo)本以及32例系統(tǒng)性紅斑狼瘡、27例干燥綜合征、10例硬皮病、20例混合性結(jié)締組織病、23例多發(fā)性硬化癥患者血清標(biāo)本，檢測(cè)這些血清標(biāo)本中的抗CCP抗體水平，計(jì)算該檢測(cè)法的臨床特異性。⑤相關(guān)性實(shí)驗(yàn)：取32例陽(yáng)性血清樣品，分別用BAS-TRFIA和ELISA兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其相關(guān)系數(shù)。⑥穩(wěn)定性試驗(yàn)：將試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對(duì)比。⑦回收率：三組含高濃度CCP抗體血清用樣本稀釋液稀釋后然后測(cè)定其濃度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS13軟件分析。分別用回歸分析和方差分析來(lái)計(jì)算相關(guān)性和測(cè)試的線性。批間和批內(nèi)變異采用CV計(jì)算。設(shè)定當(dāng)P<0.05時(shí)有認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1線性范圍將一CCP強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本從9081稀釋到0.55U/ml并同時(shí)采用BAS-TRFIA法和ELISA法檢測(cè)。這兩種方法檢測(cè)的線性范圍，如圖1所示，我們看到了BAS-TRFIA法在9463-0.58U/ml有一個(gè)很好的線性范圍，而使用ELISA法的線性范圍落在591.4-18.48U/ml，表明我們建立的BAS-TRFIA法測(cè)定抗CCP抗體具有比ELISA法更寬的檢測(cè)范圍。

圖1　用TRFIA和ELISA法分別檢測(cè)一個(gè)抗CCP抗體陽(yáng)性樣品稀釋濃度

2.2BAS-TRFIA法測(cè)定抗CCPIgG抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度與抗CCP抗體濃度成正比?？笴CP抗體IgG濃度是2365.8，591.44，147.86，36.96，9.24，0.58U/mL?？笴CP抗體對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.79071+0.79505x+0.01094x2，其中X是抗CCP抗體濃度(GPLU/ml)和Y是熒光強(qiáng)度。零點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品值加2個(gè)平均值定義為靈敏度，該方法的靈敏度是0.5U/ml。

圖2　抗CCP抗體TRFIA在不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3精密度試驗(yàn)檢測(cè)高、中、低 3 種濃度混合血清的批內(nèi)(n=20)精密度和批間(n=8)精密度，和通過(guò)ELISA法所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。如表1所示，采用TRFIA法檢測(cè)抗CCP抗體濃度為241.5，72.7，14.15U/ml的批內(nèi)CV值分別為3.16%，3.82%，4.24%，三種濃度的批間CV值分別為4.29%，4.68%，和4.97%。ELISA法檢測(cè)242.8，72.6，14.32U/m的這三種濃度的批內(nèi)CV值分別為6.12%，8.18%，和9.61%，批間CV值分別為7.268%，9.93%，和10.74%。顯然，我們建立的抗CCP抗體的BAS-TRFIA分析法的批間和批內(nèi)精密度比ELISA法高。

表1　批內(nèi)和批間精密度分析

2.4臨床應(yīng)用通過(guò)檢測(cè)52例健康獻(xiàn)血者，32例系統(tǒng)性紅斑狼瘡，27例干燥綜合征，10例硬皮病，20例混合性結(jié)締組織病，23例多發(fā)性硬化癥血清抗CCP抗體濃度來(lái)計(jì)算BAS-TRFIA法的特異性。交叉反應(yīng)如表2所示。

表2　不同類(lèi)型患者抗CCP抗體特異性

2.5與ELISA法的相關(guān)性用BAS-TRFIA法與ELISA法同時(shí)測(cè)定32份血清濃度，并比較結(jié)果。結(jié)果顯示通過(guò)兩個(gè)試驗(yàn)得到的散點(diǎn)圖顯示具有良好的相關(guān)性(如圖3)，相關(guān)系數(shù)是0.892 7。

圖3　BAS-TRFIA和ELISA的相關(guān)性

2.6BAS-TRFIA試劑盒的穩(wěn)定性將試劑盒分別在4℃和在37℃水浴存儲(chǔ)7天。然后比較BAS-TRFIA法與ELISA法的試劑盒的結(jié)合率(通過(guò)計(jì)算熒光計(jì)數(shù)值或吸光度的變化測(cè)得)。我們觀察到與常規(guī)條件下相比，BAS-TRFIA法的結(jié)合率沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的變化(僅下降了12.1%)，ELISA試劑盒下降了17.7%，29.3%，36.3%。以上數(shù)據(jù)顯示我們建立的檢測(cè)試劑盒具有良好的穩(wěn)定性(表3)。

表3　BAS-TRFIA和ELISA的穩(wěn)定性比較

2.7回收率回收率=觀察到的濃度×100 /期望的濃度。第一個(gè)樣本的回收率分別為100.98%，102.25%，和 96.45%。第二樣本的回收率分別為100.46%，98.18%，和101.59%。第三個(gè)樣本的回收率分別為104.63%，97.18%，和98.17%。平均回收率的計(jì)算是九組回收率的平均值，結(jié)果為99.98%(表4)。

表4　BAS-TRFIA試劑盒的回收率

3　討論

為便于早期診斷，一個(gè)RA血清學(xué)標(biāo)志能在疾病最早期就被檢測(cè)到是非常必要的。最近的一些研究表明抗CCP抗體可在病程早期即被檢測(cè)到，有助于該病的早期診斷。

在此，我們建立了應(yīng)用BAS系統(tǒng)的新型夾心TRFIA法，可快速定量測(cè)量臨床患者血清中抗CCP抗體水平，在傳統(tǒng)TRFIA技術(shù)和生物素親和素體高親和力相結(jié)合下具有高靈敏度的優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新的TRFIA是一種很有前途的具高靈敏度和高特異性法的免疫熒光法，同時(shí)為檢測(cè)提供了更寬的工作線性范圍和更好的重復(fù)性。在圖1中，BAS-TRFIA在9463-0.58U/ml良好的線性范圍，相比之下，ELISA試劑盒在591.4-18.48U/ml的范圍內(nèi)。而擴(kuò)大檢測(cè)范圍有利于提高RA早期診斷的靈敏度(10，11)。此外，新的方法與ELISA法具有良好的相關(guān)性相比，R2值為0.8927(圖3)。與ELISA相比，我們的建立的BAS-TRFIA其穩(wěn)定性能更好，這將保證更穩(wěn)定的收益(表3)。總而言之，我們研究建立的檢測(cè)抗CCP抗體的BAS-TRFIA法為RA的診斷和治療提供了一個(gè)更為理想的免疫方法學(xué)選擇。

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Determination of Anticyclic Citrullinated Peptide Based on Biotin-Streptavidin-Amplified Time-Resolved Fluoroimmunoassay

LI Mei,YE Yan*,HU Zhi-gang，et al.

(Department of Clinical laboratory,Affiliated Wuxi People’s Hospital to Nanjing Medical University,Wuxi 214023,China)

ObjectiveArapidandsensitivetimeresolvedfluoroimmunoassay(TRFIA)basedonthebiotin-streptavidinamplificationsystemwasdevelopedforthedeterminationofanticycliccitrullinatedpeptide(anti-CCP).MethodsEuropium-labeledstreptavidinderivativescombinedwitheuropiumandanhydrideofdiethylenetriaminepentaaceticacidwereusedtolabelstreptavidin,biotinwascoupledwithrabbitantihumanIgGtoformabiotin-anti-humanIgGbridgebetweenstreptavidin-europiumandtheanti-CCPantibodyintheimmunoassay.Theanti-CCPassaywascarriedoutbymeasuringthefluorescenceofEu3+-streptavidinat615nm.ResultsThepresentedmethodproducedawidelinearrangefrom0.58to9,463U/ml,whileitwasonly591.4-18.48U/mlwhenusinganELISAkit,andfeaturedadetectionlimitupto0.5U/mlforanti-CCP.Thevaluesdeterminedbythebiotin-streptavidin-TRFIAandELISAcorrelatedwell(R2=0.8927).Themethodwasappliedtodetermineanti-CCPinserumsampleswithsatisfiedrecoveriesof96.45-104.63%.ConclusionTheassayresultsobtainedbythepresentmethodshowedthatbiotin-streptavidin-amplifiedTRFIAimprovethetraditionalELISAkitforanti-CCPdetection.Therefore,itoffersabetteralternativeimmunoassayinrheumatoidarthritismanagement.

cycliccitrullinatedpeptide;rheumatoidarthritis;time-resolvedfluoroimmunoassay

本項(xiàng)目受南京醫(yī)科大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(JMUZD057)、無(wú)錫市醫(yī)管中心面上項(xiàng)目(YGZXM14013)資助

1007-4287(2016)08-1250-05

R446.6

A

2016-02-15)