中藥成分大腹園蛛粉的細(xì)胞及遺傳生殖毒性研究

張逸鶴，韓　旭，張　歡，萬　鑫，劉宇維，高元奇，費(fèi)　瑞

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)系，吉林 長春130021)

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中藥成分大腹園蛛粉的細(xì)胞及遺傳生殖毒性研究

張逸鶴，韓旭，張歡，萬鑫，劉宇維，高元奇，費(fèi)瑞*

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)系，吉林 長春130021)

大腹園蛛(Araneusventricosus)屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、蛛形綱(Arachnida)、蜘蛛目(Araneae)、園蛛科(Araneidae)、園蛛屬(Araneus)，是最常見的蜘蛛之一。目前，大腹園蛛在醫(yī)療、保健、食品上都有廣泛應(yīng)用。在飲食保健方面，國外有園蛛醬、園蛛口服液，而中國有園蛛羮[1]。在醫(yī)學(xué)方面，大腹園蛛同樣具有很高的藥用價(jià)殖。據(jù)相關(guān)資料記載，園蛛成體焙干后可用于治療背瘡、痔瘡、陽痿、中風(fēng)偏癱、小兒驚風(fēng)、腎陽虧虛、口噤，疔腫、毒蟲咬傷等[2-5]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，蜘蛛毒素的研究正在飛速發(fā)展，但有關(guān)蜘蛛的成體研究在國內(nèi)外并不常見，其中有關(guān)園蛛的成體毒性研究更未見報(bào)道。本文的研究結(jié)果可為大腹園蛛的進(jìn)一步開發(fā)奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

濾去殘?jiān)来蟾箞@蛛采自吉林省吉林市馮家屯,使用時(shí)烘箱焙干并制成干粉，濾去殘?jiān)画h(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)購于吉林大藥房；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；胰酶購自Hyclone，其他所用試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種純系小鼠，體重18-22 g，雌雄各半。由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：吉實(shí)動(dòng)質(zhì)(2000)042號。實(shí)驗(yàn)前在室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)兩天。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)取對數(shù)期的L929細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞生長密度至70%-80%后，消化、離心，并接種于96孔板，置37℃、5% CO2恒溫孵箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分5組，即：空白組、陽性對照組、和3種不同濃度的大腹園蛛粉組。24 h后取出培養(yǎng)板，分別加入10 μl藥物，其中空白對照組加入PBS、陽性對照組加入5%的DMSO、3種不同濃度的大腹園蛛粉組分別加入10 g/L、20 g/L和40 g/L的大腹園蛛粉(Araneus ventricosus powder,AP)。于37℃、5% CO2恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后，取出每孔加入10 μL CCK8，37℃、5% CO2恒溫孵箱孵育2 h。最后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測各孔OD殖，計(jì)算細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(RGR)[6]。

1.3.2小鼠嗜多染紅細(xì)胞的微核實(shí)驗(yàn)選用昆明小鼠50只，體重18-22 g，雌雄各半，隨機(jī)分5組，即空白對照組(蒸餾水)、陽性對照組(0.06 g/kg環(huán)磷酰胺)、2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg的大腹園蛛粉組，每組10只。小鼠每天灌胃染毒一次，灌胃劑量為0.2 mL/10 g,連續(xù)4 d。第5 d處死小鼠，取出胸骨，剃凈肌肉，除盡血污，橫向剪短胸骨，暴露骨髓腔并擠出骨髓。加一滴小牛血清并均勻涂在載玻片上。于室溫晾干后放入甲醇固定15 min，取出自然晾干，用Geimsa染色15 min后鏡檢。每張片計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算出含有微核的嗜多染紅細(xì)胞微核率，以千分率(‰)表示[7]。嗜多染紅細(xì)胞微核率(‰)=含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)/嗜多染紅細(xì)胞總數(shù)×1000。

1.3.3小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)選用健康昆明雄性小鼠50只，體重18-22 g，6-8周齡。隨機(jī)分5組，即：空白對照組(蒸餾水)、陽性對照組(0.04 g/kg環(huán)磷酰胺)、2.5 g/kg、5.0 g/kg、10 g/kg的大腹園蛛粉組，每組10只。小鼠每天灌胃染毒一次，灌胃劑量為0.2 mL/10 g,連續(xù)5 d。從染毒起第35 d脫頸處死小鼠，取兩側(cè)副睪剪碎、涂片、染色。在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)完整的1 000個(gè)精子，并根據(jù)精子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，記錄其中畸形的精子數(shù)目,計(jì)算精子畸形率，以百分率(%)表示[9,11]。精子畸形率(%)=畸形精子數(shù)/精子總數(shù)×100。

2　結(jié)果

2.1大腹園蛛粉對細(xì)胞毒性影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，陽性對照組(DMSO)細(xì)胞的相對增殖率為22%，而10 g/L、20 g/L和40 g/L的大腹園蛛粉組(AP)的相對增殖率分別為99%、94%和135%，根據(jù)細(xì)胞毒性反應(yīng)分級評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，陽性對照組為四級毒性，而3個(gè)大腹園蛛粉組都屬于一級毒。

表1　大腹園蛛粉對l929細(xì)胞毒性影響

2.2大腹園蛛粉對小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核影響

各實(shí)驗(yàn)組小鼠在給藥期間，生長狀態(tài)均無異常。以2.5 g/kg、5.0 g/kg和10 g/kg的大腹園蛛粉分別給小鼠灌胃染毒后，小鼠嗜多染紅細(xì)胞(PEC)的微核率分別為2.5‰、2.6‰和2.3‰。與空白對照(蒸餾水)組比較，差異不顯著(P>0.05)，而與陽性對照(環(huán)磷酰胺)組比較，差異極顯著(P<0.01),陽性對照組C環(huán)磷酰胺組與空白對照(蒸餾水)組比較，具有極顯著差異(P<0.01)表明大腹園蛛粉不能誘發(fā)小鼠PEC微核率的增加。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2　大腹園蛛粉對小鼠骨髓PCE 微核影響

注：與蒸餾水組比較，*P<0.01;與環(huán)磷酰胺組比較，#P<0.01。

2.3大腹園蛛粉對小鼠精子畸形的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所顯示，2.5 g/kg、5.0 g/kg和10 g/kg的大腹園蛛粉(AP)分別給小鼠灌胃染毒后，小數(shù)的精子畸形率分別為2.4%，2.4%，2.7%，與空白對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而與陽性對照(環(huán)磷酰胺)組相比，具有極顯著差異(P<0.01)。陽性對照(環(huán)磷酰胺)組與空白對照(蒸餾水)組比較，具有極顯著差異(P<0.01)。表明大腹園蛛粉對小鼠的生殖無致突變作用。

表3　大腹園蛛粉對小鼠精子畸形影響

注：與蒸餾水組比較，*P<0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，#P<0.01。

3　討論

近年來，隨著科學(xué)和時(shí)代的進(jìn)步，不少國家逐漸把眼光放到昆蟲類藥物及保健的開發(fā)上。美國鹽湖城自然產(chǎn)品公司以蜘蛛為原料已經(jīng)開發(fā)出了很多的新藥。以蜘蛛干品為原料的蜘蛛粉、蜘蛛羹目前也已風(fēng)靡全球，廣受人們喜愛。雖然大腹園蛛在中藥及飲食保健方面均有應(yīng)用，但由于其本身是有毒類動(dòng)物，其毒性大小及對人的毒性反應(yīng)尚未有報(bào)道，這嚴(yán)重阻礙了對其進(jìn)一步深入開發(fā)。本文從細(xì)胞毒性、遺傳毒、生殖毒三個(gè)角度來探究大腹園蛛的毒性，為大腹園蛛的藥物開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一類在離體狀態(tài)下，模擬體內(nèi)生存環(huán)境，檢測外來物質(zhì)接觸機(jī)體組織后生物學(xué)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。通過體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，可以檢測供試品接觸細(xì)胞后，細(xì)胞的形態(tài)和功能變化、細(xì)胞溶解、細(xì)胞生長及死亡等毒性反應(yīng)[6]。為評價(jià)大腹園蛛粉對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用，本文選取對數(shù)生長期的L929細(xì)胞作為靶細(xì)胞，采用國家GB/T14233.2-2005規(guī)定方法進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大腹園蛛粉的毒性反應(yīng)為1級，為不具有細(xì)胞毒性成分。

小鼠骨髓嗜多染微核實(shí)驗(yàn)是急性毒性常用的一種檢測方式，是檢測體外物質(zhì)對染色質(zhì)損傷的重要方法[7]。該方法能快速和簡便地檢測染色體損傷。微核試驗(yàn)因其靈敏、穩(wěn)定，且能檢測染色體完整性改變和染色體分離改變而在毒理上得到廣泛應(yīng)用[8]。微核試驗(yàn)的目的主要是通過檢測哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞的微核出現(xiàn)率，間接反映骨髓細(xì)胞染色體畸變發(fā)生率的高低，從而判斷受試物是否具有致突變作用[8-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，大腹園蛛粉的三個(gè)劑量組與空白對照組相比均無顯著差異(P>0.05)，表明大腹園蛛粉對小鼠骨髓細(xì)胞微核沒有影響，無致突變作用。

小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)是檢測物質(zhì)是否具有遺傳毒性的重要方法。雖然人或哺乳動(dòng)物的精液中可能含有畸形的精子，但在精原細(xì)胞后期和精母細(xì)胞早期，會(huì)對化學(xué)誘變劑較為敏感。在此期間給藥可提高精子畸形的突變率。因此可以用檢查雄性動(dòng)物接觸化學(xué)毒物后的精子畸形率高低，判斷該化學(xué)毒物的生殖毒性和對生殖細(xì)胞潛在的致突變性[11，12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，大腹園蛛粉的3個(gè)劑量組與空白對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)，表明大腹園蛛粉對小鼠的精子無致畸作用。

本文的研究結(jié)果證明，大腹園蛛粉屬無毒物，不能影響小鼠的生殖和遺傳特征。本研究結(jié)果不僅為大腹園蛛今后的藥物開發(fā)研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而且也為其食品開發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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吉林省自然科學(xué)基金資助(201215058)

，注：張逸鶴，韓旭具有同等貢獻(xiàn)。

1007-4287(2016)08-1243-03

2016-03-22)