銀杏葉提取物對電離輻射下大鼠骨髓間充質干細胞的保護作用機制研究

宋媛媛，呂　欣，高春時，王　瑞，張　鵬，任　明，李　波*

(1.吉林大學公共衛生學院 流行病與統計教研室，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫院 骨科)

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銀杏葉提取物對電離輻射下大鼠骨髓間充質干細胞的保護作用機制研究

宋媛媛1，呂欣1，高春時1，王瑞1，張鵬1，任明2*，李波1*

(1.吉林大學公共衛生學院 流行病與統計教研室，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫院 骨科)

目的探討銀杏葉提取物(EGB)對輻射引起大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)損傷的保護作用及機制研究。方法利用全骨髓細胞貼壁法分離純化BMSCs，取第3代細胞為實驗研究對象，并將其隨機分為5組，分別為正常對照組(Control)、輻射對照組(IR)、輻射加EGB低劑量組(IR+EGBL)、輻射加EGB中劑量組(IR+EGBM)和輻射加EGB高劑量組(IR+EGBH)；分別給予不同的處理因素。采用CCK-8法檢測各組細胞存活率，Hoechst熒光染色法檢測各組細胞凋亡率，利用熒光定量PCR法定量檢測凋亡相關基因Bax和Bcl-2 mRNA表達量，應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測凋亡蛋白caspase3的活性。結果與正常對照組相比，輻射組和輻射加EGB低、中、高劑量組細胞存活率均顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達量顯著下降(P<0.05)，促凋亡基因Bax mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，Caspase3活性顯著升高(P<0.05)；與輻射對照組相比，輻射加EGB低、中、高劑量組細胞存活率均顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，Bax mRNA表達量顯著降低(P<0.05)，Caspase3活性顯著降低(P<0.05)，均以輻射加EGB中劑量組最顯著。結論EGB可以拮抗輻射導致的BMSCs細胞存活率降低，通過caspase3通路減少輻射后BMSCs細胞凋亡，進而減輕BMSCs細胞的輻射損傷。

銀杏葉提取物；骨髓間充質干細胞；電離輻射；細胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:1235)

隨著核能、放射源和射線等在各種行業領域的廣泛應用，人們在日常生活中遭受電離輻射(Ionizing Radiation,IR)的機會越來越大[1,2]。輻射對人體損傷較大，主要可造成人體的血液、胃腸消化、神經和皮膚等一個或多個系統損傷，并且與輻射劑量和時間密切相關[3]。骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stemcells,BMSCs) 具有自我更新、旁分泌和多向分化等特性，這些特性可以給為人類細胞移植或組織器官修復重建等提供可靠的自體或異體資源[4]。銀杏葉成分復雜，銀杏葉提取物(Ginkgo biloba L.extract,EGB)具有抗氧化、清除自由基、增強機體免疫功能、抑制血小板凝聚酶、抗突變、抗衰老、抗癌、抗病毒等多方面的生理活性。有研究表明，EGB可降低受輻射小鼠骨髓細胞微核出現率和染色體畸變率[5]。本研究通過不同劑量EGB作用于受電離輻射大鼠，探討EGB對輻射引起大鼠BMSCs損傷的保護作用及機制研究。

1　材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑

出生5-7天Wista大鼠購自吉林大學動物實驗中心。銀杏葉提取物購自德國威瑪舒培博士藥廠，L-DMEM培養液和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒、Hoechst染色試劑盒和Caspase-3酶聯免疫試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，TRIZOL購自美國Thermo Fisher Scientific公司，逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自上海生工生物工程公司。

1.2大鼠BMSCs原代培養

采用全骨髓細胞貼壁法分離純化BMSCs。處死Wistar大鼠幼鼠，取出股骨，用L-DMEM培養液將骨髓沖出，制成單細胞懸液，以1×106ml-1的細胞密度接種于25 cm2培養瓶中，加入含10% FBS的L-DMEM培養液，置于37℃、 5% CO2培養箱中培養。3天后換半液，7天后細胞融合達80-90%時進行傳代。

1.3實驗分組

取第3代大鼠BMSCs細胞，將其隨機分為5組，分別為正常對照組(Control)、輻射(IR)對照組、輻射加EGB低劑量組(IR+EGBL)、輻射加EGB中劑量組(IR+EGBM)和輻射加EGB高劑量組(IR+EGBH)。Control組不給予處理因素，除Control組外其它四組細胞均給予5.0 Gy的X射線照射，IR+EGBL組加入EGB至終濃度為100 μg/ml，IR+EGBM組加入EGB至終濃度為200 μg/ml，IR+EGBH組加入EGB至終濃度為400 μg/ml。

1.4CCK-8法檢測細胞存活率

將BMSCs細胞密度調整為5×104ml-1，每孔100 μl接種于96孔板中，待細胞融合達80-90%時，于照射前1h輻射加EGB低、中、高劑量組分別加入EGB100 μg/ml、200 μg/ml和400 μg/ml，設置3復孔。照射后繼續培養24 h，每孔加入10 μl CCK-8，37度培養箱中培養2 h，應用酶標儀在450 nm處測光密度值(OD)。

1.5Hoechst染色

按細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒說明書進行操作，具體步驟如下。

1.5.1吸盡培養液，加入固定液，固定10 min。

1.5.2去固定液，用冷PBS洗2遍，3 min/次。

1.5.3加入Hoechst33258染色液，染色5 min。

1.5.4去染色液，用冷PBS洗2遍，3 min/次。

1.5.5滴加抗熒光猝滅劑封閉

1.5.6采用激發波長350 nm，發射波長460 nm，熒光顯微鏡下觀察并拍照

1.5.7計數1000個BMSCs細胞中發射凋亡細胞的個數，計算細胞凋亡百分率。

1.6熒光定量PCR法檢測Bax和Bcl-2 mRNA表達

1.6.1總RNA提取：按照Invitrogen TRIZOL試劑說明書進行操作，提取細胞總RNA。

1.6.2cDNA的合成：按照M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書配置反應液：取總RNA 1 μg，加入1 μl隨機引物，用無RNA酶水定容至12 μl，65℃溫浴5 min，冰浴30 s，然后在反應液中加入5×Recation Buffer 4 μl、RNase Inhibitor 1 μl、dNTP Mix 2 μl、M-MuLV RT 1 μl，混勻后25℃溫浴10 min，42℃溫浴60 min，70℃加熱10 min。

1.6.3熒光定量PCR：按照2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒說明書配置反應液：取cDNA 0.2 μl，加入2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μl、上/下游引物各0.4 μl(10 μM each)、雙蒸水定容至20 μl。目的基因Bax、Bcl-2及內參基因GAPDH引物序列見表1。反應程序如下：95℃預變性5 min，95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，反應重復35個循環。反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳及繪制熔解曲線檢測其擴增效果。反應完畢后數據采用2-ΔΔCt方法處理。

表1　目的基因Bax、Bcl-2及內參基因GAPDH引物序列

引物序列按5’→3’排序，F：上游引物，R：下游引物

1.7ELISA法檢測Caspase3活性

按照Caspase3活性測定試劑盒說明書進行檢測，具體步驟如下。

1.7.1吸取培養液，胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養液中。

1.7.2600 g 4℃離心5 min，收集細胞，吸除上清，PBS洗滌。

1.7.3加入50 μl裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。

1.7.44℃ 20,000 g離心10 min，收集上清液。

1.7.5加入Ac-DEVD-pNA (2 mM)。

1.7.637℃孵育60-120 min。發現顏色變化比較明顯時，測定A405。

1.8統計學方法

2　結果

2.1CCK-8法檢測EGB對電離輻射下BMSCs細胞存活率的影響

輻射可顯著降低BMSCs細胞存活率，IR+EGB組細胞存活率顯著高于IR組，尤其是IR+EGBM組最為明顯(P<0.05)，見圖1。提示EGB對輻射下的BMSCs細胞有保護作用。

*:與Control組相比，P<0.05；#:與IR組相比，P<0.05；△:與IR+EGBM組相比，P<0.05

圖1EGB對電離輻射下BMSCs細胞存活率的影響

2.2Hoechst染色法檢測EGB對電離輻射下BMSCs細胞凋亡的影響

如圖2所示，BMSCs細胞在正常狀態下細胞核呈圓形，輻射后BMSCs細胞核皺縮、染色質濃集，呈強藍色熒光。圖3的結果表明與Control組相比，IR組、IR+EGBL組、IR+EGBM和IR+EGBH組BMSCs細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，EGB能顯著降低因輻射所致升高的細胞凋亡率，尤其是IR+EGBM組最為明顯(P<0.05)。

圖2　各組細胞Hoechst熒光染色圖片(×200)

*:與Control組相比，P<0.05；#:與IR組相比，P<0.05；△:與IR+EGBM組相比，P<0.05

圖3EGB對電離輻射下BMSCs細胞凋亡的影響

2.3各組細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達

如圖4所示，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳呈獨立、清晰的條帶，長度與設計預期相符合；擴增產物熔解曲線呈單峰，結果表明擴增產物符合設計預期要求。

如圖5所示，與Control組相比，IR組、IR+EGBL組、IR+EGBM和IR+EGBH組BMSCs細胞抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達量顯著下降(P<0.05)，促凋亡基因Bax mRNA表達量顯著升高(P<0.05)；與IR組相比，IR+EGBL組、IR+EGBM和IR+EGBH組BMSCs細胞抗凋亡基因Bcl-2mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，促凋亡基因Bax mRNA表達量顯著降低(P<0.05)，以IR+EGBM組最顯著。

圖4熒光定量PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳(A)及熔解曲線(B)

*:與Control組相比，P<0.05；#:與IR組相比，P<0.05；△:與IR+EGBM組相比，P<0.05

2.4各組細胞Caspase3活性

輻射可激活BMSCs細胞Caspase3通路，Caspase3活性顯著升高，IR+EGB組細胞Caspase3活性顯著低于IR組，尤其是IR+EGBM組最為明顯(P<0.05)，見圖6。

3　討論

現今，人們不可避免的生活在各種程度的電離輻射下。而電離輻射不僅可對細胞產生損傷[6]，在一次照射一定劑量時對人及動物也產生損傷，低劑量電離輻射對植物和動物也會產生一定的刺激作用[7]。

研究發現，輻射造成的長期骨髓抑制主要依賴殘留的造血干細胞和BMSCs進行恢復[8,9]。本實驗采用大鼠BMSCs為研究對象，用CCK-8法檢測EGB對電離輻射下BMSCs細胞存活率的影響。研究發現輻射組BMSCs細胞存活率明顯低于對照組，BMSCs細胞凋亡率顯著升高，加入不同劑量EGB可提高電離輻射后的BMSCs細胞存活率，其中IR+EGBM中劑量組效果最好，顯著降低因輻射所致升高的BMSCs細胞凋亡率。提示EGB對BMSCs細胞存活具有保護作用。Caspase家族蛋白酶在細胞凋亡過程中發揮重要作用，Caspase3是效應Caspase分子的重要代表，是凋亡的關鍵蛋白酶，被稱為“死亡蛋白酶”，Caspase3被激活后即發生下游的一系列級聯反應，使凋亡不可避免[10]。有研究發現，沉默Caspase3 可加快BMSCs的生長速度并提高一定條件下其抗凋亡能力[11]。

*:與Control組相比，P<0.05；#:與IR組相比，P<0.05；△:與IR+EGBM組相比，P<0.05

圖6EGB對電離輻射下BMSCs細胞Caspase3通路的影響

本研究顯示，電離輻射可激活BMSCs的Caspase3通路，Caspase3活性顯著升高，加入EGB后 Caspase3活性顯著低于IR組，其中EGB中劑量組效果最明顯，提示EGB可以通過作用于Caspase3通路來降低輻射后BMSCs的細胞凋亡率，為EGB的進一步臨床應用奠定實驗基礎。

4　結論

4.1EGB可以拮抗電離輻射造成的BMSCs細胞存活率降低。

4.2EGB通過caspase 3通路減少輻射后BMSCs細胞凋亡，進而減輕BMSCs細胞的輻射損傷。

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The protective effects of Ginkgo biloba extract on ionizing radiation-induced rat bone marrow mesenchymal stem cells injury

SONG Yuan-yuan1,LV Xin1,GAO Chun-shi1,et al.

(1.DepartmentofEpidemiologyandBiostatistics,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun,Jilin130021,China;2.DepartmentofOrthopedics,SecondHospital,JilinUniversity)

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism on radiation-induced rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) damage.MethodsUsing the method of whole bone marrow adherent cells isolated purified BMSCs,3rd passage cells as experimental study,and were randomly divided into five groups,namely normal control group (Control),radiation control group (IR),radiation and EGB low dose group (IR+EGBL),radiation and EGB medium dose group (IR+EGBM) and radiation and EGB high dose group (IR+EGBH),were given different treatment factors respectively.Cell viability was detected Using CCK-8 method,the apoptotic rate was detected by Hoechst Staining,mRNA expression of Bax and Bcl-2 were detected by quantitative real-time PCR and caspase3 activity was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsCompared with normal control group,the cell survival rate of IR,IR+EGBL,IR+EGBM and IR+EGBH group were significantly lower (P<0.05),the apoptosis rate were significantly higher (P<0.05),mRNA expression of antiapoptotic gene Bcl-2 were significantly lower (P<0.05),and mRNA expression of promote apoptosis gene Bax were significantly higher (P<0.05),Caspase3 activity were significantly higher (P<0.05);Compared with the radiation group,the cell survival rate of the IR+EGBL,IR+EGBM and IR+EGBH group were significantly higher (P<0.05),the apoptosis rate were significantly lower (P<0.05),the mRNA expression of Bcl-2 were significantly higher (P<0.05),the mRNA expression of Bax were significantly lower (P<0.05),Caspase3 activity were significantly lower (P<0.05),IR+EGBM group had the most significant change.ConclusionEGB can antagonize the cell viability lowing of BMSCs reduced by radiation,through inhibiting caspase 3 path reducing to BMSCs apoptosis after radiation,thereby reducing radiation damage of BMSCs cells.

Ginkgo biloba extract;Bone marrow mesenchymal stem cells;Ionizing radiation;Apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81503531)；吉林省教育廳"十二五"科學技術研究項目(吉教科合字[2015]第536號)；吉林省衛生計生委科技計劃項目〔2015Q024〕；吉林大學白求恩計劃項目(2015404)

1007-4287(2016)08-1235-05

R285.5

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2016-05-15)