殺蟲活性化合物杠柳新苷P對東方粘蟲中腸細胞上結(jié)合蛋白的影響

齊　猛，何振宇，李任豐，胡兆農(nóng)

(1.西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)藥研究所，陜西楊凌　712100； 2.陜西省植物源農(nóng)藥研究與開發(fā)重點實驗室，陜西楊凌　712100)

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殺蟲活性化合物杠柳新苷P對東方粘蟲中腸細胞上結(jié)合蛋白的影響

齊猛1，2，何振宇1，2，李任豐1，2，胡兆農(nóng)1，2

(1.西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)藥研究所，陜西楊凌712100； 2.陜西省植物源農(nóng)藥研究與開發(fā)重點實驗室，陜西楊凌712100)

杠柳新苷P是從杠柳根皮提取物中分離得到的一種甾體糖苷類化合物，對東方粘蟲表現(xiàn)出較好的殺蟲活性。為了進一步研究其殺蟲機理，探究杠柳新苷P作用于東方粘蟲中腸疑似作用位點，通過對杠柳新苷P進行結(jié)構(gòu)修飾，與東方粘蟲幼蟲中腸刷狀緣膜囊泡(BBMV)組織體外孵育，利用其結(jié)構(gòu)修飾后增強的紫外吸收特性，經(jīng)蛋白分離、純化，進而得到杠柳新苷P作用于粘蟲中腸BBMV上的結(jié)合蛋白。結(jié)果表明:在粘蟲中腸BBMV上存在杠柳新苷P的疑似結(jié)合蛋白，且經(jīng)分離鑒定得到5種疑似結(jié)合蛋白，分別為類異翅盤蛋白、氨肽酶、二硫鍵異構(gòu)酶、苯基貯存蛋白以及精氨酸激酶；通過進一步的分析推測，氨肽酶可能是杠柳新苷P作用于東方粘蟲幼蟲中腸BBMV上的結(jié)合蛋白。初步明確杠柳新苷P作用于東方粘蟲中腸的疑似作用位點，但仍需進一步的驗證工作進行確認，為今后研究杠柳新苷類化合物的作用機理及靶標提供依據(jù)。

杠柳新苷P；東方粘蟲；刷狀緣膜囊泡；結(jié)合蛋白

杠柳(PeriplocasepiumBunge)是蘿藦科(Asclepias)杠柳屬的一種蔓生性灌木，是一種具有祛風濕、強心、強筋骨的傳統(tǒng)中草藥。《中國土農(nóng)藥志》記載了杠柳根皮可毒殺二十八星瓢蟲、菜青蟲、蚜蟲、孑孓、黑蓋子蟲等，因此，民間也一直將杠柳根皮作為殺蟲土農(nóng)藥使用[1]。國內(nèi)亦有關(guān)于其殺蟲活性的報道，史清華等[2]、朱九生等[3-4]報道杠柳根皮的提取物對小菜蛾幼蟲、菜青蟲、粘蟲具有較強的胃毒活性，對麥二叉蚜有較好的觸殺活性。

近10 a來，西北農(nóng)林科技大學農(nóng)藥研究所采用生物活性追蹤方法對杠柳根皮提取物開展一系列關(guān)于其殺蟲活性物質(zhì)的基礎(chǔ)研究，并且分離出一系列杠柳新苷類化合物[5-8]。在對東方粘蟲(Mythimnaseparata)室內(nèi)毒力測定中，發(fā)現(xiàn)杠柳新苷P具有較好的殺蟲活性，中毒試蟲腹部明顯腫脹、發(fā)黑，不能彎曲，不能爬行。為進一步研究杠柳新苷類化合物的作用機理，采用激光共聚焦顯微鏡及透射電鏡觀察病變試蟲的中腸組織結(jié)構(gòu)，粘蟲幼蟲中腸細胞膜，細胞器膜及其他超微結(jié)構(gòu)都被破壞[6-8]，因此，推測在東方粘蟲幼蟲中腸腸壁細胞膜和細胞器膜上可能存在與杠柳新苷P特異性結(jié)合的靶標蛋白。另外，根據(jù)蘇云金芽孢桿菌(Bt)的相關(guān)研究表明，Bt毒素的受體蛋白主要存在于刷狀緣膜囊泡(BBMV)上，例如V-ATP 酶(V-ATPase)、氨肽酶 N(Aminopeptidase N，APN)及堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)等[9-12]。根據(jù)前期進一步的組織病理學研究及膠體金免疫定位研究表明，杠柳新苷類化合物可能作用于東方粘蟲中腸上的BBMV[13]。因此，猜測認為杠柳新苷P的結(jié)合蛋白存在于粘蟲中腸的BBMV中。

鑒于杠柳新苷P極其微弱的紫外吸收不利于檢測，本試驗擬通過N-甲基靛紅酸酐(N-Methylisatoic anhydride，MIA)對杠柳新苷P進行修飾，利用蛋白分離純化手段，對東方粘蟲中腸BBMV上的疑似結(jié)合蛋白進行檢測分離，為進一步研究杠柳新苷類化合物作用于東方粘蟲幼蟲中腸上的靶蛋白的鑒定提供參考。

1　材料與方法

1.1材 料

杠柳新苷P(純度≥95%)，化學結(jié)構(gòu)如圖1所示，由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)藥研究所提供。

東方粘蟲(Mythimnaseparata)，由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)藥研究所養(yǎng)蟲室提供，常規(guī)方法飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃、相對濕度為70%～80%的條件下，是以小麥或玉米葉飼養(yǎng)、室內(nèi)人工累代飼養(yǎng)(18 a)的敏感品系，試驗時挑取整齊一致的剛蛻皮6齡幼蟲。

1.2杠柳新苷P標記物的合成

稱取34 mg杠柳新苷P，5.6 mg N-甲基靛紅酸酐(MIA)，5.3 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)于25 mL干燥的反應(yīng)瓶中，用6 mL無水N, N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，常溫下磁力攪拌反應(yīng)過夜，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全，向體系中加入1 mL甲醇進行淬滅反應(yīng)，減壓蒸出溶劑，經(jīng)高效液相色譜制備得到杠柳新苷P標記物(圖1)。

1.3粘蟲中腸BBMV的提取

采取SPSS11.0軟件進行分析,計量資料(均數(shù)±標準差)表示,t檢驗,計數(shù)資料(n,%)表示,x2檢驗,P<0.05差異存在統(tǒng)計學意義。

參照Wolfersberger 等[14]的差速離心法(Mg2+/EGTA法)，具體操作步驟如下：(1)將饑餓處理之后的6齡幼蟲置于冰上15 min，從幼蟲后部的第3、4節(jié)之間縱剖開，取中腸，用w=0.7%的NaCl沖洗中腸，吸干水，稱量后置于-70 ℃冰箱中保存(最長不可超過6個月)或直接制備BBMV；(2)加9倍質(zhì)量的冰冷緩沖液A(300 mmol/L D-mannotil，5 mmol/L EGTA，17 mmol/L Tris，1 mmol/L PMSF，PH 7.5)于玻璃勻漿器中，在冰上與中腸進行充分的勻漿，每勻漿1 min冰冷1 min，重復5～6次；(3)往勻漿液中加入等體積24 mmol/L MgCl2，混勻置于冰上15 min，4 ℃、4 500 r/min離心15 min，保留上清；(4)將上一步所得沉淀重懸于4.5倍體積的冰冷緩沖液A，后加等體積的24 mmol/L MgCl2，重復步驟(3)，再次收集上清；(5)將2次所得上清合并，4 ℃、30 000g離心30 min，保留沉淀；(6)將所得沉淀加入等體積的冰冷緩沖液B(150 mmol/L D-mannotil，2.5 mmol/L EGTA，8.5 mmol/L Tris，1 mmol/L PMSF，pH 7.5)冰浴4 h，重懸混勻，4 ℃、30 000g離心15 min；(7)棄上清，取沉淀重懸于冰冷緩沖液C(150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EGTA，20 mmol/L Tris，w=1%的 CHAPS ，1 mmol/L PMSF，pH 7.5)，即為提取的BBMV，分裝，-80 ℃保存。

1.4Q-Sepharose陰離子交換柱層析

(1)用Tris-HCl(pH 7.5，2 mmol/L) 緩沖液平衡Q-Sepharose陰離子交換柱；(2)樣品的處理：上樣前，蛋白樣品(BBMV)分別與DMSO、杠柳新苷P，杠柳新苷標記物P-MIA、鄰甲氨基苯甲酸甲酯(MIA與羥基反應(yīng)生成物)在29 ℃體外孵育1 h；(3)將過濾后的BBMV以每次6 mL的上樣量上樣于AKTA蛋白純化儀(Amashia)的進樣閥，流速為0.5 mL/min；(4)在UV 350 nm下監(jiān)測吸收值，收集未與交換柱結(jié)合的蛋白；(5)待樣品完全吸附于交換柱后，用含1 mol/L NaCl 的Tris-HCl(pH 7.5，2 mmol/L)緩沖液以1 mL/min的流速梯度洗脫，鹽離子體積分數(shù)上限為50%，每管1 mL收集洗脫餾分，分別標記為A1、A2、A3、…、An，洗脫總體積為50 mL；(6)在UV 350 nm波長的吸收值下進行監(jiān)測，選取差異餾分保存待用。

1.5差異餾分的處理

透析袋的預處理：φ=50%乙醇煮沸1～2 h，用0.01 mol/L的NaHCO3，1 mmol/L的EDTA，φ=50%乙醇依次煮脫10 min。將差異餾分分別置于處理好的透析袋中，用0.02 mol/L 的Tris-HCl(pH=7.5)的透析液4 ℃下透析12 h，后將透析完全的蛋白溶液在低溫真空冷凍干燥機(Labogene, 型號CS110-4)凍干。

1.6SDS-PAGE電泳

配制10%分離膠，5%濃縮膠，在電泳槽中加1 L電極緩沖液(14.4 g甘氨酸，3 g Tris，1 g SDS)取相同體積(20 μL)的各樣品上樣于點樣孔中，濃縮膠80V、25 min，分離膠120 V、90 min。卸膠后考馬斯亮藍染色液染色2 h，脫色液[V(甲醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=1∶1∶8]過夜脫色，用凝膠成像系統(tǒng)(型號BIO-RAD)掃描照相。

1.7LC-MS-MS蛋白質(zhì)譜(Q-TOF)分析

將電泳所得到的疑似結(jié)合蛋白條帶，送到北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進行檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1杠柳新苷P標記物的鑒定

杠柳新苷P標記物為白色粉末，熔點167～169 ℃，ESI-MS質(zhì)譜顯示準分子離子峰[M+Na]+為m/z1 412.51，表明該化合物的相對分子質(zhì)量為1 389.52，與理論值相符。結(jié)合核磁共振譜圖分析，1H NMR譜(500 MHz, CDCl3)顯示杠柳新苷P標記物較原料杠柳新苷P多出δH:7.88(1H,m)，7.30(1H,m)，6.70(2H,m)，3.46(3H,s)等2-N-甲基苯甲酰基上的氫信號，13C NMR譜(125 MHz, CDCl3)顯示多出，δC:168.61,150.46,134.08,131.24,116.70, 116.30, 110.83, 31.94等2-N-甲基苯甲酰基的碳信號，表明杠柳新苷P標記物P-MIA結(jié)構(gòu)是正確的。

2.2不同處理組BBMV的紫外色譜圖

由圖2中4個不同處理在350 nm的紫外色譜圖可以看出，圖2-a、2-b、2-d 3個處理的紫外色譜圖的趨勢是大體相同的，而MIA標記過的杠柳新苷P處理組(圖2-c)的第2個洗脫峰的峰值要明顯高于其他3組，此處的紫外吸收明顯增強，并且由圖2-c可知A7、A8餾分是該差異峰的主要組分。

由電導率方面來看，4個圖譜中樣品的電導率趨勢以及數(shù)值均一致，表明在同一體系下，同一紫外吸收波長下，不同處理組的洗脫峰值上顯示明顯差異，該洗脫峰中可能存在杠柳新苷P的結(jié)合蛋白。

a.不作處理的對照組Control group；b.杠柳新苷P處理組Periplocoside P treatment group；c.杠柳新苷P標記物P-MIA處理組Periplocoside P-MIA treatment group；d.鄰甲氨基苯甲酸甲酯處理組Dimethyl anthranilat treatment group；圖中橫坐標上部的A1、A2等字母表示洗脫餾分The A1,A2 and other letters on the upper part of the abscissa in the picture show the elution fractions

圖2離體孵育BBMV各處理組的紫外色譜圖

Fig.2 UV chromatogram for different treatment groups of BBMV (in vitro)

2.3BBMV差異組分的SDS-PAGE電泳

由圖3可看出，A7、A8餾分中各有2條蛋白條帶(圖3所示1、2)，未結(jié)合蛋白跟高鹽洗脫出的蛋白并沒有相對應(yīng)的這2條帶，而在BBMV對照蛋白條帶中卻是存在的，再結(jié)合圖2的紫外吸收差異圖譜，餾分中存在蛋白條帶能夠結(jié)合到柱子上引起紫外吸收增強,可推測這2條蛋白帶即疑似結(jié)合蛋白所在的條帶。

Ⅰ.Marker；Ⅱ.BBMV；Ⅲ.結(jié)合的BBMVUnbinding BBMV；Ⅳ.結(jié)合蛋白A7 Binding proteins A7；Ⅴ.結(jié)合蛋白A8Binding proteins A8；Ⅵ.高鹽緩沖液洗脫餾分The eluted fraction with high salt buffer solution

圖3離體孵育BBMV差異餾分的SDS-PAGE電泳圖

Fig.3SDS-PAGE of different fractions of the BBMV(in vitro)

2.4BBMV中疑似蛋白條帶的Q-TOF質(zhì)譜鑒定

對上述蛋白條帶進行Q-TOF質(zhì)譜分析，對獲得的肽段二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Mascot軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索，獲得相互匹配的肽段或蛋白，最后把P<0.05的鑒定結(jié)果作為最終的鑒定結(jié)果(表1)。

經(jīng)過膠內(nèi)酶解、肽段提取、肽段對比等步驟鑒定得到5種結(jié)合蛋白，與蛋白條帶1匹配的蛋白分別是斜紋夜蛾(Spodopteralitura)的類異翅盤蛋白、棉鈴蟲(HelicoUerpaarmigera)的氨肽酶和苯基貯存蛋白；家蠶(Bombyxmori)的二硫鍵異構(gòu)酶、以及Cyphononyxfulvognathus的精氨酸激酶分別與蛋白條帶2中的蛋白相對應(yīng)。

表1　粘蟲中腸BBMV中杠柳新苷P結(jié)合蛋白鑒定結(jié)果

3　討 論

本試驗利用杠柳新苷P與受體蛋白之間的相互作用，初步探究粘蟲中腸BBMV中存在的杠柳新苷P結(jié)合蛋白。通過LC-MS-MS蛋白質(zhì)譜技術(shù)初步鑒定出5種杠柳新苷P的疑似結(jié)合蛋白，分別為類異翅盤蛋白、氨肽酶、二硫鍵異構(gòu)酶、苯基貯存蛋白以及精氨酸激酶。

昆蟲的中腸作為消化器官是食物消化和養(yǎng)分吸收的主要場所，而中腸BBMV上也存在著大量已知或未知的病毒或殺蟲毒素受體[15]。本試驗鑒定得到的上述5種蛋白質(zhì)，在昆蟲體內(nèi)的物質(zhì)代謝、能量代謝、營養(yǎng)貯存及生長發(fā)育等生理過程中承擔著重要的角色。類異翅盤蛋白在斜紋夜蛾翅的形成過程以及羽化發(fā)育過程起到重要作用，運用RNAi技術(shù)表明試蟲不能從蛹期正常轉(zhuǎn)變到成蟲，影響昆蟲變態(tài)發(fā)育的正常進行[16]。而芳基貯存蛋白只局限存在于大多數(shù)完全變態(tài)的昆蟲的幼蟲階段，對于其功能的理解被認為是一個蛋白質(zhì)庫，其降解的寡肽和氨基酸可以供成蟲發(fā)育和變態(tài)過程利用[17]。這2種蛋白都與粘蟲的變態(tài)發(fā)育相關(guān)，而杠柳新苷P是作用于中腸組織進而發(fā)揮胃毒作用，與粘蟲的變態(tài)發(fā)育并沒有相關(guān)的聯(lián)系。二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)屬于硫氧還蛋白超家族，是一個多功能蛋白。在 N 端具有信號肽，C 端具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化新生二硫鍵形成、蛋白折疊、組裝、翻譯后修飾以及非正確二硫鍵的異構(gòu)[18]。本試驗中還檢測到精氨酸激酶，精氨酸激酶在鱗翅目昆蟲如煙草天蛾中腸中，能夠催化ATP和精氨酸中間的磷酸基團進行可逆性交換，之后將能量存儲于磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中，或者將磷酸精氨酸分解為ATP，是一個與ATP再生和細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)等直接相關(guān)的重要激酶，參與能量代謝[19]。通過對上述蛋白的功能性分析并結(jié)合杠柳新苷P的作用癥狀、作用方式以及前期的作用機理研究，推測氨肽酶可能是杠柳新苷P的疑似結(jié)合靶蛋白。

氨肽酶是一組肽鏈端裂解酶，它屬于鋅依賴性多肽酶家族，具有鋅指結(jié)構(gòu)和N端連接的糖基化位點，通過從N端催化切除多肽的中性氨基酸殘基而發(fā)揮各種各樣的細胞代謝調(diào)節(jié)功能，廣泛存在于動物和植物中[20]。研究證實在大多數(shù)鱗翅目昆蟲的中腸BBMV內(nèi)，氨肽酶是Bt等毒素的受體蛋白，并且Bt和受體蛋白的結(jié)合能力與毒性呈正相關(guān)[21]。迄今為止從煙草天蛾(Manducasexta)幼蟲、煙芽夜蛾(HeliothisUirescens)幼蟲的中腸上鑒定到結(jié)合的受體蛋白是120 ku的氨肽酶[22]；在舞毒蛾(Lymantriadispar)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、家蠶、棉鈴蟲等鱗翅目昆蟲和一些雙翅目昆蟲幼蟲的BBMV上也發(fā)現(xiàn)有數(shù)種氨肽酶是Cry1A等毒素的受體蛋白[23-26]。

氨肽酶作為Bt毒素的受體蛋白之一，Cry毒素-APN互作的生物相關(guān)性已有大量的研究報道，其中Cry 毒素與APN結(jié)合后插入昆蟲中腸上皮細胞膜形成孔洞的作用機制被廣泛接受[27-28]。從癥狀學觀察粘蟲幼蟲對Bt毒素的中毒典型癥狀表現(xiàn)為試蟲蟲體癱軟，而同等條件下杠柳新苷P對粘蟲的中毒癥狀表現(xiàn)為腹部明顯腫脹、發(fā)黑，不能彎曲，不能爬行，并且對中毒試蟲解剖后發(fā)現(xiàn)中腸內(nèi)伴有氣泡出現(xiàn)，表明杠柳新苷P與Bt毒素的作用機制完全不同。由于昆蟲中腸內(nèi)種類繁多的受體蛋白、酶蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白等均是以相互作用、相互依存的狀態(tài)存在,協(xié)同執(zhí)行各種功能，共同參與各項生理生化過程，因此，杠柳新苷P是直接作用于氨肽酶發(fā)揮作用還是通過氨肽酶介導相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑而產(chǎn)生的殺蟲機制，具體的生理生化反應(yīng)尚不清楚，還有待于進一步的探討和驗證。

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Corresponding authorHU Zhaonong,male,Ph.D,professor.Research area:pesticide toxicology.E-mail: huzhaonong@nwsuaf.edu.cn

(責任編輯：成敏Responsible editor:CHENG Min)

Effect of Active Insecticidal Periplocoside P onMythimnaseparataMidgut Cell Binding Proteins

QI Meng1,2, HE Zhenyu1,2, LI Renfeng1,2and HU Zhaonong1,2

(1.Institution of Pesticide Science, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China; 2.Key Laboratory of Botanical Pesticide R&D in Shaanxi Province,Yangling Shaanxi712100,China)

The periplocoside P is a kind of steroidal glycoside compound isolated from the root bark ofPeriplocasepiumBunge, which showed good insecticidal activity toMythimnaseparatalarvae.In order to study the insecticidal mechanism of periplocoside P, and research the suspected action site for the periplocoside P in the midgut ofMythimnaseparate, this paper modified the structure of periplocoside P and then incubated it with the BBMV in vitro.Though the enhanced UV absorption value, the binding protein is separated and purified from the BBMV in the midgut ofMythimnaseparatalarvae.The results showed that suspected binding protein of periplocoside P exists in the BBMV in the midgut ofMythimnaseparatalarvae.After the isolation, purification and identification, five kinds of suspected binding proteins was got, which is abnormal wing disc-like protein, aminopeptidase N, protein disulfide isomerase, arylphorin and arginine kinase-like protein, respectively.Through further analysis, we speculated that aminopeptidase N may be the most likely binding protein of the periplocoside P.In this paper, we preliminary make clear the suspected action site for the periplocoside P in the midgut ofMythimnaseparate,but further validation research still needs.This study provides a foundation and basis for further study on insecticidal mechanism and target location of the periplocosides compounds.

Periplocoside P;Mythimnaseparate; BBMV; Binding protein

2015-04-27Returned2015-05-21

National Natural Science Foundation of China(No.31171868); the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.QN2011058).

QI Meng,male,master student.Research area:pesticide toxicology.E-mail:15753118831@163.com

2015-04-27

2015-05-21

國家自然科學基金(31171868)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(QN2011058)。

齊猛，男，碩士研究生，從事農(nóng)藥毒理學研究。E-mail:15753118831@163.com

胡兆農(nóng)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事農(nóng)藥毒理學研究。 E-mail: huzhaonong@nwsuaf.edu.cn

S481+.1

A

1004-1389(2016)08-1250-07

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-07-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1105.040.html