牛羊鮮乳冷藏過程中蛋白質沉淀率比較及粒度分析

田萬強，王　亮，田蘇輝，朱莉莉，李林強，梅楚剛，昝林森

(1.楊凌職業技術學院 動物工程分院，陜西楊凌　712100；2.陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，西安710119； 3.西安宏興乳業公司，陜西臨潼　710600；4.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌　712100)

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牛羊鮮乳冷藏過程中蛋白質沉淀率比較及粒度分析

田萬強1，王亮2，田蘇輝3，朱莉莉2，李林強2，梅楚剛4，昝林森4

(1.楊凌職業技術學院 動物工程分院，陜西楊凌712100；2.陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，西安710119； 3.西安宏興乳業公司，陜西臨潼710600；4.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌712100)

旨在分析牛羊鮮乳冷藏過程中蛋白質沉淀率變化及粒度大小。通過離心沉淀、原子力顯微鏡、激光粒度分析儀、SDS-PAGE 電泳分析牛羊鮮乳冷藏過程中蛋白質沉淀率變化、鮮乳蛋白質粒子形貌、粒徑分布范圍、酪蛋白組成。結果表明：羊乳蛋白質沉淀率顯著高于牛乳；牛乳蛋白質粒子數目(45 μL-1)、密度(1.8 μm-2)低于羊乳蛋白粒子數目(437 μL-1)、密度(17.48 μm-2)；牛乳蛋白粒度大小主要集中在1 nm以下，羊乳蛋白粒度只有19.3%在1 nm以下，主要分布在1～1 000 nm，其中100 nm左右最多；牛羊乳酪蛋白主要有β酪蛋白和αs1酪蛋白2種，分子質量分別為34 ku和26 ku左右。牛乳蛋白質冷藏穩定性顯著高于羊乳，羊乳蛋白質顆粒直徑大于牛乳，牛羊乳蛋白質粒子數目和大小是影響冷藏穩定性差異的主要因素；原子力顯微鏡結合激光粒度儀是分析乳蛋白粒度大小的有效手段。

牛乳；羊乳；蛋白質；沉淀率；粒度

牛乳在冷藏和加工過程中會產生一定量的蛋白沉淀，即使經過均質，熱處理后隨著貨架期延長沉淀現象也較為明顯[1-4]，羊乳則更為嚴重。影響乳穩定性的因素有酸度[5-6]、酪蛋白組成[7-8]、乳清蛋白和酪蛋白的比例[9-10]、處理溫度[11-15]等，這些因素導致蛋白質粒子凝聚，直徑增大，膠體結構遭到破壞，布朗運動消失，產生沉淀。劉紅霞等[16]發現攪拌和均質條件不同，牛羊乳粒度大小和穩定性不同；李子超等[17]和Anema等[18-19]研究發現熱處理使牛乳的酪蛋白粒子直徑發生變化，產生沉淀，可見蛋白質粒度大小是影響乳穩定性的直接物理因素。牛羊乳蛋白質沉淀率差異是由二者本身粒度大小差異所致，還是僅由外因所致，相關研究相對較少。有研究[20]報道牛乳酪蛋白平均粒徑大于羊乳，但難于解釋羊乳無論是冷藏還是熱處理后沉淀率高于牛乳的事實。因此，牛羊鮮乳蛋白質粒度大小的差異及其對蛋白質沉淀率的影響尚需進一步研究。

1985年Binning 和 Quate發明原子力顯微鏡(AFM)[21]，AFM 能在納米尺度水平測到物體的微觀結構[22]，并且可以呈現樣品表面的三維形貌[23]，甚至可以在離子緩沖溶液中進行成像[24]，基于原子力顯微鏡的這些優點，本研究使用原子力顯微鏡表征牛羊乳蛋白質粒子微觀形貌，并結合使用激光粒度分析儀測定牛羊鮮乳蛋白質粒度大小，試圖更加全面反映牛羊乳蛋白粒子大小差異，以期揭示牛羊乳粒度對蛋白沉淀率的影響，為改善乳蛋白穩定性提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材 料

牛羊乳采自西北農林科技大學畜牧站荷斯坦牛和薩能奶山羊。

1.2主要試劑

蛋白Mark(SM 0671，Fermentas公司)，干酪素(01-010，北京奧博星生物技術有限責任公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、硝酸銀、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸、甘油、β-巰基乙醇、溴酚藍、鹽酸、氯化鈉、三氯乙酸、戊二醛、碳酸鈉、甲醛、檸檬酸、醋酸鈉、氫氧化鈉、醋酸、φ=95%乙醇、乙醚等均為分析純。

1.3主要儀器

臺式離心機(800 B，上海安亭科學儀器廠)，原子力顯微鏡(Veeco Bruker，J探頭)，激光粒度分析儀(MS 2000，英國馬爾文儀器公司)，電泳系統(PowerPacTM Universal，美國Bio-rad伯樂)，凝膠成像系統(Universal Hood II，XRS，美國Bio-rad)。

1.4方 法

1.4.1蛋白質沉淀率的測定常溫牛羊乳樣2～4 ℃ 冷卻保存，每12 h取乳樣1次，采用400 g相對離心力離心15 min，傾出上液，稱量沉淀蛋白，每次平行測定3個樣，共測定5次，按下式計算蛋白沉淀百分率。

W=(m1/m)×100

式中W為100 g乳中蛋白沉淀百分率；m1為沉淀蛋白質量，單位為g；m為樣液質量，單位為g。

1.4.2蛋白質粒子形貌觀察取10 mL乳樣400 g相對離心力離心15 min，除去上層脂肪，加入等體積乙醚，通過分液漏斗進一步脫脂。取脫脂乳樣1 mL，稀釋25倍，超聲處理10 min，取1 μL樣液滴于云母片上，自然風干，用Veeco Bruker原子力顯微鏡J探頭進行形貌觀察。

1.4.3粒度測定各取50 mL牛羊乳，加入等體積乙醚，靜置10 min，1 200 g離心力離心15 min，傾去上層脂肪，用激光粒度分析儀測定粒度大小及其相應體積分數。

1.4.4酪蛋白組成的SDS-PAGE電泳分析取牛羊乳各30 mL，200 g相對離心力離心5 min，棄去上層脂肪；下層液體加入等體積0.2 mol·mL-1醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.6)，搖勻后加熱至40 ℃，冷卻至室溫，放置5 min，200 g相對離心力離心5 min后傾出上層液體，沉淀物用蒸餾水洗滌，200 g相對離心力離心5 min，洗滌重復3次。所得沉淀物即為粗酪蛋白。將粗酪蛋白置于30 mLφ=95%乙醇中洗滌，200 g相對離心力離心5 min，洗滌重復2次，再用乙醚洗滌2次，抽濾，將所得沉淀物攤開在表面皿上，使乙醚完全揮發，所得即為酪蛋白。

取酪蛋白1 mg溶于1 mL樣品緩沖液中，沸水加熱5 min。配制12%分離膠加入凝膠板中，凝固40 min，加入3%濃縮膠，凝固40 min，在加樣孔中加入樣品10 μL，80 V恒壓 40 min，然后100 V恒壓2.5 h后停止電泳；φ=20%三氯乙酸浸泡凝膠板8 h，150 mL去離子水充分洗滌凝膠板20 min，重復洗滌3次；φ=1% 戊二醛溶液150 mL避光浸泡凝膠板6 h，去離子水洗滌10 min，重復洗滌3次；氨銀染液100 mL避光染色20 min；去離子水150 mL洗滌凝膠表面2次，每次1 min。加入顯色液至顯色清晰后棄去顯色液，去離子水洗滌2次，每次1 min，加入終止顯色液終止顯色。

1.5數據處理

運用 SPSS19.0 軟件進行數據處理，方差顯著性分析采用LSD法，結果以“平均數±標準差”表示。

2　結果與分析

2.1牛羊乳蛋白質沉淀率

圖1表明，牛乳在2～4 ℃冷藏過程中蛋白質發生沉淀，但在60 h內無顯著增加(P>0.05 )；羊乳則在24 h后沉淀率顯著增加(P<0.05)，且冷藏過程中蛋白質沉淀率顯著高于牛乳(P<0.05)。張小苗[25]認為羊乳膠體穩定性低于牛乳，另有研究[4,26-27]表明羊乳的熱穩定性低于牛乳。結果提示羊乳穩定性遠低于牛乳。

圖1　牛羊乳冷藏過程中沉淀率動態變化

2.2牛羊乳蛋白質粒子形貌的原子力顯微鏡觀察

從圖2、3蛋白質粒子形貌分析可知，牛乳蛋白粒子數目(45 μL-1)、密度(1.8 μm-2)明顯低于羊乳蛋白粒子數目(437 μL-1)、密度(17.48 μm-2)；牛乳蛋白質顆粒平均直徑(100.106 nm)大于羊乳(80.407 nm)，羊乳中雖然存在一定數量直徑較大的蛋白顆粒(圖3)，但是,牛乳的蛋白質粒子數目遠遠少于羊乳蛋白質粒子數目，所以這可能影響2種乳蛋白質顆粒的平均直徑大小，總體表現為牛乳大于羊乳，這也與Fava等[28]、Jenness[29]和李子超等[20]報道羊乳蛋白質粒子平均直徑比牛乳小的結果一致。但是羊乳冷藏穩定性為什么低于牛乳的事實，看來難于用乳蛋白質顆粒平均直徑大小解釋，原因可能還需進一步探究。由圖2、3剖面分析結果可見：羊乳蛋白質粒子表面起伏程度較大(-5 nm～+5 nm)，牛乳蛋白質粒子表面起伏程度則相對較小(-4 nm～+4 nm)，表明羊乳蛋白質顆粒大小分布范圍較大,存在較大直徑蛋白顆粒,結果提示牛羊乳蛋白粒子直徑平均值不能真實反映牛羊乳蛋白質粒子大小差異，蛋白質顆粒數目和其大小應該是共同影響牛羊乳穩定性差異的主要因素。

圖2　牛乳蛋白質粒子形貌(左)及其剖面圖(右)

2.3牛羊乳蛋白質粒度

由圖4可知，牛乳蛋白粒度大小主要集中在1 nm以下。由圖5可知，羊乳蛋白粒度只有19.3%在1 nm以下，主要分布在1～1 000 nm，其中100 nm左右最多，結果表明，羊乳蛋白顆粒直徑差異較大，存在較大數量大顆粒蛋白質粒子，這與原子力顯微鏡分析結果一致。表明牛羊乳蛋白粒徑大小是影響其冷藏穩定性差異的主要因素之一。

2.4牛羊乳酪蛋白SDS-PAGE

由圖6可知，牛羊乳酪蛋白主要有β-酪蛋白和αs1酪蛋白，這與Bramanti等[30]、Crudden等[31]和Veloso等[32]的研究結果一致，依據標準蛋白Marker，β酪蛋白和αs1酪蛋白分子質量分別為34 ku和26 ku左右，這與郭軍等[33]、趙麗麗[34]報道羊乳的β酪蛋白分子質量大于αs1酪蛋白結果類似。表明酪蛋白分子質量不是影響牛羊乳冷藏穩定性差異的主要原因，牛羊乳酪蛋白結構差異可能是影響兩者穩定性差異的基礎性因素。

圖4　牛乳蛋白粒度大小

圖5　羊乳蛋白粒度大小分布

圖中條帶1～2分別為鮮牛羊乳酪蛋白,條帶3為干酪素標品Band 1 and 2 are caseins from cow milk and goat milk respectively,and band 3 is the standard casein

圖6牛羊乳酪蛋白SDS-PAGE

Fig.6SDS-PAGE of caseins in cow and goat milk

3　結 論

牛乳的冷藏穩定性顯著高于羊乳；牛乳蛋白質粒子數目和密度均低于羊乳；牛乳蛋白粒度大小主要集中在1 nm以下，羊乳蛋白粒度主要分布在1～1 000 nm。羊乳蛋白質顆粒直徑大于牛乳，蛋白質粒子數目和大小是影響牛羊乳冷藏穩定性差異的主要因素；原子力顯微鏡結合激光粒度儀是分析乳蛋白質粒度大小的有效手段。

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Corresponding authorLI Linqiang,male,Ph.D,associate professor.Research area: animal products and functional food.E-mail:lilinq@snnu.edu.cn

(責任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Comparison of Protein Sedimentation Rate and Particles Size of Milk from Cow and Goat during Cold Storage

TIAN Wanqiang1,WANG Liang2,TIAN Suhui3,ZHU Lili2,LI Linqiang2,MEI Chugang4and ZAN Linsen4

(1.Animal Engineering Department,Yangling Vocational and Technical College,Yangling Shaanxi712100,China;2.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an710119,China;3.Xi’an Hongxing Dairy Company,Lintong Shaanxi710600,China; 4.College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China )

In this paper,protein sedimentation rate changes of milk from cow and goat during cold storage and their particles size were explored.Particle morphology,particle size distribution,casein composition of protein from fresh milk of cow and goat were analyzed by centrifugal sedimentation,atomic force microscope,laser particle size analyzer,and SDS-PAGE electrophoresis,respectively.The results showed that the sedimentation rate of goat milk protein was significantly higher than that of cow milk.The count of cow milk protein particles (45 μL-1),and density (1.8 μm-2) were lower than those (437 μL-1and 17.48 μm-2respectively) of goat milk.Goat milk protein particle size was mainly in less than 1 nm range,however,the same size was only 19.3% in cow milk,and mainly distributed in 1-1 000 nm range,and focused on 100 nm.Beta casein and alpha s1- casein were two main kinds of casein in cow and goat milk,with molecular weight of 34 ku and 26 ku respectively.Storage stability of cow milk protein was significantly higher than that of goat.Cow milk protein particles diameter was larger than that of goat milk,and the milk protein particles count and their sizes were the main factors on milk protein cold storage stability.Atomic force microscopy combined with laser particle size analyzer is an effective method to analyze the particle size of milk protein.

Cow milk; Goat milk; Protein; Sedimentation rate; Particles size

2015-09-11Returned2015-10-13

Shaanxi Science and Technology Development Project (No.2014K13-20，2011K01-09); National Science and Technology Support Program (No.2012BAD12B07); Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2007C127).

TIAN Wanqiang,male,Ph.D,associate professor.Research area: livestock breeding and production process and quality control of livestock products.E-mail:twqiang2003@163.com

2015-09-11

2015-10-13

陜西省科學技術發展計劃(2014K13-20，2011K01-09)；國家科技支撐計劃(2012BAD12B07)；陜西省自然科學基金(2007C127)。

田萬強，男，博士，副教授，研究方向為家畜遺傳育種及畜產品生產加工與質量控制。E-mail:twqiang2003@163.com

李林強，男，博士，副教授，研究方向為畜產品及功能食品。E-mail: lilinq@snnu.edu.cn

TS252.2

A

1004-1389(2016)08-1144-06

網絡出版日期：2016-07-14

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1103.010.html