聚肌胞增強肝癌細胞HepG2對甲氨蝶呤化學敏感性的機制

王麗（河南科技大學第一附屬醫院，河南洛陽471003）

聚肌胞增強肝癌細胞HepG2對甲氨蝶呤化學敏感性的機制

王麗
（河南科技大學第一附屬醫院，河南洛陽471003）

目的 探討聚肌胞（PolyI：C）增強肝癌細胞對甲氨蝶呤（MTX）化學敏感性的機制。方法 體外培養肝癌細胞HepG2，并隨機分成對照組、MTX組、聯合組，對照組加入生理鹽水，MTX組加入MTX至20 μg/mL，聯合組加入MTX至20 μg/mL和PolyI：C至50 μg/mL。MTT法檢測各組細胞增殖抑制率，流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，PCR法檢測各組細胞中維甲酸誘導基因1（RIG-1）、干擾素β（IFN-β）和半胱胺酸天冬胺酸轉移酶3（Caspase-3）mRNA表達，蛋白免疫印跡法檢測RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白表達。結果 聯合組與MTX組相比，細胞增殖抑制率和凋亡率均顯著升高，而RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平亦顯著提高兩組比較差異有統計學意義（P均＜0.05）。結論 PolyI：C通過上調RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA及蛋白表達，促進肝癌細胞的抑制和凋亡，從而增強MTX對肝癌細胞的化學敏感性。

肝腫瘤；聚肌胞；甲氨蝶呤；化學敏感性

肝細胞肝癌（HCC）是一種起源于肝細胞的惡性腫瘤，僅有小部分可進行切除或進行肝移植，大部分患者需行藥物治療［1］。甲氨蝶呤（MTX）是肝細胞癌的化療藥物之一，但長期大劑量使用MTX，正常肝細胞會引起損傷，肝癌細胞亦可產生耐藥性［2］。聚肌胞（PolyI：C）是一種人工合成雙鏈RNA，可于體內誘導不同細胞產生干擾素α和干擾素β（IFN-β）［3］。研究表明，PolyI：C在誘導干擾素產生的同時，可抑制腫瘤細胞生長［4］。2014年3月～2015年4月，我們通過PolyI：C聯合MTX作用于肝癌細胞株HepG2，觀察肝癌細胞HepG2對MTX化學敏感性的變化并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、DMEM細胞培養基購自Gibico公司；胰酶購自Amresco公司；TRIzol試劑和轉染脂質體Lipofectamin2000均購于Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購自Thermo公司。注射用MTX購自齊魯制藥公司；聚肌胞購自廣東邦民制藥廠。鼠抗人RIG-1單克隆抗體、鼠抗人IFN-β單克隆抗體、鼠抗人Caspase-3單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體和HRP標記的羊抗鼠IgG均購自Santa Cruz公司；肝癌細胞株HepG2細胞為本實驗室保存。

1.2 細胞培養及分組 肝癌細胞HepG2使用含10%FBS的高糖DMEM，置于37℃、5%CO2的培養箱內培養，細胞生長至90%融合，用0.25%胰酶消化細胞，將HepG2細胞濃度調整為5×104/mL，種入6孔培養板和96孔培養板，細胞過夜貼壁后換液，并分成三組，即對照組、MTX組和聯合組，對照組加入生理鹽水，MTX組加入MTX至20 μg/mL，聯合組加入MTX至20 μg/mL和PolyI：C至50 μg/ mL；6孔板每組設3個平行孔，96孔板每組設12個平行孔，加藥后繼續培養72 h。

1.3 細胞增殖抑制率測算 采用MTT法。將分組加藥處理的96孔板細胞拿出培養箱，每孔加入5 mg/mL的MTT試劑20 μL，置37℃、5%CO2培養箱繼續培養4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL/孔，于振蕩器上振蕩5 min，用酶標儀檢測每孔570 nm波長處的OD值。根據公式計算出HeLa細胞增殖抑制率：抑制率（IR）=（對照組OD值均數-實驗組OD值均數）/對照組OD值均數。實驗重復進行3次。

1.4 細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。將分組處理的6孔板細胞用0.25%的胰酶將細胞消化后，分別加入完全培養基終止消化，吹打混勻，2 000 r/ min離心5 min，用PBS洗滌細胞1次，2 000 r/min離心5 min收集細胞沉淀，重懸細胞，分別加入PI染色液避光靜置5 min，最后用75%乙醇固定，流式細胞儀檢測。

1.5 細胞維甲酸誘導基因1（RIG-1）、IFN-β和半胱胺酸天冬胺酸轉移酶3（Caspase-3）mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。將分組加藥處理72 h的6孔板細胞按照一步法提取細胞中總RNA，準確定量2 μg RNA，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。各取等量基因使用SYBGreen染料進行實時定量細胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA表達檢測。PCR條件：95℃預變性5 min進入循環，95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s并讀取熒光值，共45個循環，獲取Ct值，計算mRNA相對表達量。

1.6 細胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白表達檢測采用蛋白免疫印跡法。收集6孔板處理的三組細胞，加入細胞裂解液，混勻后置冰上15 min，13 000 r/min，離心5 min，收集上清液用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。分別取等量蛋白電泳，濕式電轉移法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，再用3%脫脂牛奶室溫封閉2 h。分別加鼠抗RIG-1單克隆抗體、鼠抗IFN-β單克隆抗體和鼠抗Caspase-3單克隆抗體為一抗（1∶1 000），以鼠抗人β-actin單克隆抗體為內參抗體（1∶2 000）。4℃孵育過夜，PBST洗膜3次。加入HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗（1∶2 000），37℃孵育2 h，PBST洗膜3次。于暗室滴加ECL化學發光液，然后壓片、顯影、定影。實驗重復3次。應用Scion Image軟件分析灰度值，蛋白相對定量值=目的基因灰度值/內參基因灰度值。

1.7 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。以One-Way ANOVA模塊對各組檢測指標進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率及凋亡率比較 與對照組比較，MTX組和聯合組對HepG2細胞增殖均具有明顯抑制作用（P均＜0.05）；而聯合組與MTX組比較，HepG2細胞增殖抑制更明顯（P＜0.05）。與對照組相比，MTX組和聯合組細胞凋亡率均升高（P均＜0.05），聯合組細胞凋亡率比MTX組更高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞增殖抑制率和凋亡率比較

2.2 各組細胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA表達比較 聯合組細胞RIG-1、IFN-β mRNA水平高于對照組和MTX組（P均＜0.05），對照組和MTX組比較無統計學差異（P＞0.05）。MTX組和聯合組細胞中Caspase-3 mRNA水平均高于對照組（P均＜0.05），而聯合組Caspase-3 mRNA水平比MTX組更高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA表達比較

2.3 各組細胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白水平比較 聯合組細胞RIG-1、IFN-β蛋白水平高于對照組和MTX組（P均＜0.05），MTX組和對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。而MTX組和聯合組細胞Caspase-3蛋白水平均高于對照組（P均＜0.05），聯合組中水平比MTX組更高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組細胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白表達比較

3 討論

肝癌傳統治療包括手術、放療和化療等多種方法［5］。手術和放療僅在腫瘤早期、部位局限時應用，中晚期肝癌患者多數需藥物化療。但多數中晚期肝癌對MTX、氟尿嘧啶、順鉑等化療藥物敏感性不高，尤其是單藥治療有效率更低［6］。

PolyI：C是一種病毒雙鏈RNA的模擬物。有文獻報道，其不僅對免疫細胞（如自然殺傷細胞）具有激活作用，而且還可直接誘導腫瘤細胞凋亡［7］。其一方面可與Toll受體3（TLR3）結合，激活TLR3通路，發揮天然免疫和抗腫瘤免疫作用；另一方面，PolyI：C于體內誘導不同細胞產生干擾素。干擾素是體內多種細胞釋放的一種糖蛋白，具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡的作用。因此PolyI：C已作為一種有效的抗腫瘤免疫佐劑被廣泛研究，既可單獨用作免疫治療，亦可結合其他免疫藥物及細胞毒藥物而應用。

Caspases活性變化是細胞凋亡的重要調節機制，Caspases是所有凋亡信號傳導的共同通路［8］。目前已發現在人體內的Caspases共有14種，其中起核心作用的是Caspase-3［9］。Caspase-3與肝癌亦有密切關系［10］，Caspase-3是抗腫瘤藥物作用的極好靶點［11］。研究表明，細胞對MTX反應性很大程度上依賴于細胞p53和Caspases的功能［12］。本研究顯示，聯合組、MTX組與對照組相比，RIG-1、IFN-β 和Caspase-3表達均顯著上調；同時聯合組的細胞增殖抑制率、細胞凋亡率明顯高于MTX組和對照組。證實PolyI：C能增強肝癌細胞對MTX的化學敏感性，其機制可能為PolyI：C通過激活TLR3通路，上調RIG-1，誘導IFN-β表達，同時激活Caspase-3抑制了肝癌細胞的增殖，促進了肝癌細胞的凋亡，增強了化療效果。

綜上所述，PolyI：C通過上調RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA及蛋白表達，促進肝癌細胞的抑制和凋亡，從而增強MTX對肝癌細胞的化學敏感性。

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