BCRP過表達對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

于兆進，余澗坤，于麗鳳，魏敏杰，趙琳（中國醫科大學藥學院，沈陽110001）

BCRP過表達對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

于兆進，余澗坤，于麗鳳，魏敏杰，趙琳
（中國醫科大學藥學院，沈陽110001）

目的 探討乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）基因過表達對人乳腺癌細胞MDA-MB-435S增殖和凋亡的影響。方法取對數生長期的MDA-MB-435S細胞，將其隨機分為三組，陽性轉染組將真核表達質粒pcDNA3.1/BCRP經雙酶切和測序鑒定后轉染MDA-MB-435S細胞，陰性對照組同步轉染2 μg pcDNA3.1的空質粒，空白對照組用2 mL原培養液正常培養。采用RT-PCR法和Western blotting法檢測BCRP mRNA和蛋白表達。轉染后48 h，每組再分設7個絲裂霉素（MMC）濃度（0.01、0.10、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L）組，每個濃度組3個復孔，加入相應濃度的MMC 10 μL，采用CCK-8法檢測細胞增殖情況；流式細胞術分析細胞凋亡情況。結果 重組真核表達質粒pcDNA3.1/BCRP經雙酶切和測序證實該質粒構建正確；陽性轉染組轉染24、48、72 h后，MDA-MB-435S細胞中BCRP mRNA和蛋白表達均明顯增加（P均＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性轉染組轉染pcDNA3.1/BCRP 48 h后，細胞凋亡率無統計學差異（P＞0.05）；CCK-8結果顯示，化療藥物MMC作用24 h后，與陰性對照組比較，陽性轉染組轉染pcDNA3.1/BCRP 48h后細胞存活率顯著增加（P＜0.05）。結論 BCRP過表達可促進人乳腺癌細胞MDA-MB-435S增殖，但對細胞凋亡無明顯影響。

乳腺癌；乳腺癌耐藥蛋白；細胞增殖；細胞凋亡

乳腺癌是對化療較敏感的實體瘤之一，術后化療可明顯降低乳腺癌患者的復發率，10年生存率提高10%左右［1］。然而，內在性和獲得性的多藥耐藥性（MDR）產生是引起化療失敗的重要原因。乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）是從耐藥的人乳腺癌細胞株MCF7/AdrVP中用RNA指紋分析法分離出來的跨膜半轉運蛋白，與乳腺癌耐藥作用最為相關。由位于人染色體4q22的ABCG2基因編碼，包含2.4 kb mRNA翻譯的655個氨基酸殘基、1個ATP結合域和1個疏水性跨膜結構域［2］。BCRP通過水解ATP供能將轉運底物（化療藥物）從細胞內逆濃度梯度泵到細胞外［3］，特異性使乳腺癌細胞內米托蒽醌、拓撲替康、阿霉素、羅丹明123等濃度下降，從而導致細胞對藥物抵抗、誘導耐藥性產生［4～7］。2014年11月～2015年5月，我們用pcDNA3.1-BCRP-cDNA質粒轉染乳腺癌細胞MDA-MB-435S，構建BCRP基因過表達細胞模型，觀察乳腺癌細胞增殖和凋亡的變化，為進一步研究BCRP在乳腺癌中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 MDA-MB-435S細胞（中國醫科大學藥理教研室凍存），pcDNA3.1真核表達載體、感受態大腸桿菌E.Coli DH5α、小量及大量質粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；限制性內切酶HindⅢ、BamH I、人源性反轉錄酶（AMV）、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；pMD18-T克隆載體及dNTP （Promega）；LipofectamineTM2000（Invitrogen）；PVDF膜（美國Miliipore）；引物合成及測序由上海生物工程技術公司完成；Annexin V FITC凋亡試劑盒（晶美生物工程有限公司）；絲裂霉素（MMC，大連美侖生物技術有限公司）；CCK-8試劑盒（日本DOjinDO）。PCR擴增儀（美國PE 9600）；流式細胞儀（美國BD FACS Calibur）；倒置熒光顯微鏡CCD成像系統（日本OLYMPUS）。

1.2 細胞培養及轉染 MDA-MB-435S細胞用含抗生素的10%FBS高糖DMEM培養基，于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養傳代，轉染前1 d胰酶消化，調整細胞密度至1×105/mL，每孔2 mL接種6孔板。培養18～24 h，細胞達90%融合。將細胞隨機分為三組，陽性轉染組取2 μg質粒加入250 μL DMEM培養基中，得到A液。取4 μL Lipofectamine 2000加于250 μL DMEM培養基中，得到B液，室溫靜置5 min。將A和B液混勻，室溫靜置20 min后均勻滴于1.5 mL細胞培養基中，輕輕晃動細胞培養板，混合均勻，分別培養24、48、72 h；陰性對照組同步轉染2 μg pcDNA3.1的空質粒，其余操作同陽性轉染組；空白對照組用2 mL原培養液正常培養。

1.3 質粒鑒定 將pMD18-T/BCRP重組質粒用HindⅢ和BamH I雙酶切，回收BCRP cDNA片段，并與經HindⅢ和BamH I雙酶切的真核表達載體pcDNA3.1進行連接反應，用連接產物轉化感受態的大腸桿菌DH5α，挑取含氨芐青霉素抗性的陽性克隆，擴大培養后按質粒提取試劑盒說明書提取質粒，以HindⅢ和BamH I雙酶切鑒定。細胞瞬時轉染綠色熒光蛋白質粒48 h后，熒光顯微鏡下觀察，計算帶有綠色熒光的細胞百分比，轉染效率=（綠色熒光細胞數/總細胞數）×100%。

1.4 BCRP mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計定量。以隨機引物于M-MLV逆轉錄酶的作用下逆轉錄合成cDNA，反應條件為30℃10 min，50℃30 min，95℃5 min，5℃5 min，1個循環。而后以反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，反應條件為94℃45 s，55℃45 s，72℃30 s，30個循環。

1.5 BCRP蛋白表達檢測 采用RIPI蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白量。取25 μg蛋白樣品上樣，進行10%SDS-PAGE，電泳結束取出凝膠，用轉印儀將蛋白轉移在PVDF膜上。轉移膜經5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入兔抗BCRP單克隆抗體（1∶500稀釋），4℃孵育過夜，PBST洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，PBST洗膜，用ECL化學發光法檢測BCRP蛋白表達，以β-actin作為內參，試驗重復3次。

1.6 細胞存活率測算 將對數生長期的MDA-MB-435S細胞，接種至96孔板中，每孔100 μL細胞懸液（5×103個細胞），培養過夜后，陽性轉染組與陰性轉染組按前述方法轉染陽性質粒及陰性質粒（每孔質粒和轉染試劑用量為6孔板的1/20），同步設置空白對照組。轉染后48 h，棄板內液體，重新加入培養基后，每組再分設7個MMC濃度組（0.01、0.10、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L），每個濃度組3個復孔，加入相應濃度的MMC 10 μL，繼續培養24 h后，棄板內液體，重新加入培養基，然后每孔加入CCK-8工作液10 μL，37℃孵育1 h，60 r/min振蕩10 min，用安圖酶標儀450 nm檢測OD值，并計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.7 乳腺癌細胞凋亡情況檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染法。將對數生長期細胞接種至6孔板中，每孔2 mL細胞懸液（3×105個細胞），37℃、5%CO2培養箱中培養過夜后，按前述方法轉染陽性及陰性對照質粒，培養箱中培養72 h，按照凋亡試劑盒說明書上步驟進行處理并通過流式細胞儀檢測。

1.8 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組數據比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BCRP過表達質粒的鑒定 抽提質粒進行HindⅢ/BamHⅠ酶切后進行凝膠電泳，可見2 381 bp和5 400 bp兩個基因片段，證明重組質粒中含有BCRP cDNA全長；成功構建的的重組質粒pcDNA 3.1/BCRP，片段長度為7.9 kb。電泳結果見圖1。

圖1 pcDNA3.1/BCRP質粒HindⅢ和BamHⅠ酶切產物的電泳分析

2.2 BCRP過表達質粒的轉染效率 細胞瞬時轉染綠色熒光蛋白質粒48 h后，熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，MDA-MB-435S轉染效率為40.21%±4.18%。熒光顯微鏡照相結果見圖2。

圖2 熒光顯微鏡觀察質粒轉染前后的MDA-MB-435S細胞

2.3 轉染pcDNA3.1/BCRP重組質粒后乳腺癌細胞中BCRP mRNA表達 重組質粒pcDNA3.1/BCRP轉染MDA-MB-435S細胞后24、48、72 h，BCRP mRNA表達較空白對照組增加（68.18±12.45）%、（107.80± 22.62）%、（182.93±31.78）%（P均＜0.01）；陰性對照組BCRP mRNA表達（0.064±0.012）較空白對照組（0.071±0.015）無明顯增加（P＞0.05），見圖3。

圖3 RT-PCR法檢測MDA-MB-435S細胞中轉染重組質粒后BCRP mRNA表達

2.4 轉染pcDNA3.1/BCRP重組質粒后乳腺癌細胞中BCRP蛋白表達 重組質粒pcDNA3.1/BCRP轉染MDA-MB-435S細胞后24、48、72 h，BCRP蛋白表達水平較空白對照組分別增加（17.46± 4.66）%、（72.71±15.05）%和（85.34±19.56）% （P＜0.05）；陰性對照組BCRP表達水平（0.059± 0.008）較空白對照組（0.066±0.014）無明顯增加（P＞0.05）。見圖4。

圖4 Western blotting法檢測MDA-MB-435S細胞中轉染重組質粒后BCRP蛋白表達

2.5 BCRP基因過表達對乳腺癌細胞增殖的影響

化療藥物MMC作用24 h后，與陰性對照組比較，轉染pcDNA3.1/BCRP 48 h后細胞存活率顯著增加（P＜0.05）。見圖5。

圖5 CCK-8法檢測MDA-MB-435S細胞轉染后細胞存活率

2.6 BCRP基因過表達對乳腺癌細胞凋亡的影響

轉染后48 h，陽性轉染組MDA-MB-435S細胞凋亡率（53.24%±6.86%）與陰性對照組（51.08%± 5.20%）比較無統計學差異（P＞0.05），見圖6。

3 討論

圖6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測三組MDA-MB-435S細胞凋亡

BCRP基因位于4q22～23，編碼665個氨基酸殘基。BCRP跨度超過66kb，包括16個外顯子和15個內含子，轉錄起始位點在第二個外顯子上，第一個外顯子含有大量的5＇端不翻譯區，在此區存在三種未翻譯的外顯子（E1a、Elb、E1c），這些變異體在藥物篩選細胞系中的表達及翻譯起始位點均不同，在MCF-7細胞系中以Elc為主并被高效翻譯［8］。BCRP首先在人乳腺癌細胞株中被發現，但其并非乳腺癌所特有。研究表明，以米托蒽醌（MX）誘導人結腸癌細胞株HCT-116、人小細胞肺癌細胞株GLC4、人骨髓瘤細胞株RPMI8226等獲得的耐藥株均可檢測到BCRP過表達［9～11］。除MX外，近年來發現Topo I抑制劑拓撲替康、伊立替康等亦能誘導細胞BCRP的過表達。通過抑制BCRP的表達已成為逆轉腫瘤耐藥的重要手段，Xie等［12］報道，RNAi抑制人絨毛膜癌細胞中BCRP表達后，可增加細胞對化療藥物的敏感性。此外，本研究還發現，微小RNA-miR-181a、487a靶向抑制BCRP表達后，可增加乳腺癌細胞對阿霉素和米托蒽醌的敏感性［13］。

本研究應用基因重組技術構建了DH5α真核表達質粒pcDNA3.1/BCRP，經酶切和測序分析堿基排列順序正確，沒有突變，證實質粒構建成功。該質粒可在MDA-MB-435S細胞內介導BCRP的合成，使得BCRP在細胞中的表達顯著增高，繼BCRP過表達的耐藥細胞株誘導成功之后，成功構建了BCRP過表達MDAMB-435S細胞模型。并且該質粒帶有neo基因，能夠進行真核細胞轉染后的G418壓力篩選試驗，有可能篩選出BCRP基因過表達的陽性單細胞克隆，并建立目的基因過表達的細胞株。以上實驗研究為闡明BCRP在乳腺癌細胞中的生物學功能及進一步研究BCRP在乳腺癌發生發展和多藥耐藥產生過程中的作用奠定了一定的實驗基礎。

進一步研究發現，MDA-MB-435S在轉染pcDNA 3.1-BCRP-cDNA質粒后BCRP表達明顯增加，加入MMC 24 h后細胞存活率升高，即細胞對MMC敏感性降低，該結果與BCRP可介導腫瘤細胞耐藥性一致。同時細胞凋亡變化不大，但具體作用機制還需進一步研究。本實驗為進一步研究BCRP在乳腺癌細胞中的作用及其機制奠定了基礎，對其功能的進一步研究可能為更有效地治療癌癥提供新途徑。

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Influence of BCRP overexpression on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells

YU Zhaojin，YU Jiankun，YU Lifeng，WEI Minjie，ZHAO Lin
（Department of Pharmacology，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate the effect of breast cancer resistance protein（BCRP）overexpression on cell proliferation and apoptosis of breast cancer cells MDA-MB-435S.Methods MDA-MB-435S cells in the logarithmic phase were randomly divided into three groups：the positive transfection group，in which the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1/BCRP was identified by restriction analysis and sequencing and then was transfected into MDA-MB-435S cells，the positive control group，in which the cells were transfected with 2 μg pcDNA3.1 empty plasmid at the same time，and the blank control group，in which the cells were cultured with 2 mL nutrient solution.The mRNA and protein expression of BCRP was determined by RT-PCR and Western blotting，respectively.After 48-hour transfection，7 mitomycin（MMC）concentration groups（0.01，0.10，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00 μmol/L）were set up in each group，each concentration group had 3 complex holes which were added with 10 μL MMC.Cell counting kit-8（CCK-8）and flow cytometry were used to determine the influence of BCRP on cell proliferation and apoptosis of MDA-MB-435S cells，respectively.Results Restriction analysis and sequencing proved that recombinant plasmid pcDNA3.1/BCRP was constructed correctly. Both the expression of BCRP mRNA and protein was up-regulated in MDA-MB-435S cells after transfection 24，48 or 72 h in the positive transfection group（P＜0.05）.No significant difference was found between the positive transfection group and the negative control group（P＞0.05）.After MMC treatment of 24 hours，CCK-8 showed that the cell survival rate in the transfection group was significantly higher than that of the negative control group（P＜0.05）.Conclusion BCRP overexpression promotes the proliferation of MDA-MB-435S cells，but has no significant effect on apoptosis.

breast carcinoma；breast cancer resistance protein；cell proliferation；apoptosis

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.006

R737.9

A

1002-266X（2016）25-0020-04

國家自然科學基金資助項目（81573462）；遼寧省高等學校優秀人才支持計劃項目（LJQ2015118）。

于兆進（1983-），男，講師，博士研究生在讀，主要研究方向為分子腫瘤藥理學研究。E-mail：yuzhaojin19830813@163.com

簡介：趙琳（1979-），女，副教授，博士研究生，主要研究方向為分子腫瘤藥理學研究。E-mail：zl_cmu@163.com

2015-11-25）