哮喘小鼠肺組織中Galectin-3和核因子NF-κB的表達(dá)及意義

黃娟 王立瓊 程首超 程學(xué)文 趙紅玲 羅運(yùn)春★

哮喘小鼠肺組織中Galectin-3和核因子NF-κB的表達(dá)及意義

黃娟 王立瓊 程首超 程學(xué)文 趙紅玲 羅運(yùn)春★

目的 探討半乳糖凝集素3（Galectin-3）和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在哮喘小鼠模型肺組織中的作用及相關(guān)性。方法 用卵清白蛋白建立哮喘模型。BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組、哮喘組、地塞米松治療組，每組10只。留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)；應(yīng)用ELISA法檢測(cè)BALF中IL-4、IFN-γ濃度，采用免疫組化分別檢測(cè)和Galectin-3和NF-κB的表達(dá)。結(jié)果 （1）免疫組化顯示，哮喘組肺組織中 Galectin-3蛋白表達(dá)和相應(yīng)的氣道上皮NF-κB活化強(qiáng)度均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（2）哮喘組肺組織中Galectin-3 蛋白表達(dá)與相應(yīng)的氣道上皮NF-κB活化及BALF中IL-4濃度均成正相關(guān)（P＜0.01）。結(jié)論 哮喘小鼠肺組織NF-κB和Galectin-3表達(dá)均增加，NF-κB可能上調(diào)Galectin-3的表達(dá)。

哮喘 NF-κB 半乳糖凝集素-3 IL-4 IFN-γ

半乳糖凝集素-3（gal-3），是半乳糖家族最重要的成員之一，是近年來(lái)被認(rèn)識(shí)到新的炎癥因子和生物學(xué)標(biāo)記物，其參與炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，抗凋亡和介導(dǎo)細(xì)胞粘附等多種生物學(xué)功能［1］。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，具有廣泛生物學(xué)活性，激活后可調(diào)控多種炎性蛋白的合成，參與哮喘的炎癥反應(yīng)和氣道重塑。兩者在哮喘小鼠模型中的關(guān)系國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。2014年6月至2015 年6月作者采用免疫組化法研究哮喘小鼠氣道上皮NF-κB活化情況及肺組織中Galectin-3的表達(dá)，分析其在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)性，為進(jìn)一步探討哮喘的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1哮喘小鼠模型的建立 SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠30只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，21～35d，體重14～18g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組），哮喘組（B組），地塞米松治療組（C組），每組各10只。采用V級(jí)卵清白蛋白OVA制備模型，哮喘模型的制作參照文獻(xiàn)［2］的方法略作改進(jìn)。分致敏、激發(fā)兩個(gè)階段，第8天和第21天腹腔注射0.1ml含1%OVA的Al （OH）3凝膠致敏，各1次，共2次，第32天開(kāi)始使用空氣壓縮霧化器向置于密閉有機(jī)玻璃容器內(nèi)的小鼠噴霧1%OVA，每天吸入30min，連續(xù)定時(shí)激發(fā)1周。對(duì)照組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 各組末次激發(fā)＜24h處死，眼球動(dòng)脈取血，收集血清，每只小鼠左肺迅速留取肺組織，部分透明，石蠟包埋連續(xù)切片，用以光電鏡標(biāo)本制作和免疫組化，右肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗并留取支氣管肺泡灌洗液（BALF），2000r/min離心15min，取上清液-80℃保存Eppendorf管用以檢測(cè)IFN-γ和IL-4濃度。支氣管肺泡灌洗小鼠收取BALF，細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)使用瑞氏染色。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定BALF中IFN-γ、IL-4濃度，測(cè)定方法按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。免疫組化SP法測(cè)肺組織中NF-κB活化值和Galectin-3的表達(dá)，測(cè)定方法按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。正態(tài)分布及方差齊時(shí)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way-ANOVA），兩兩比較方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett'T3檢驗(yàn)，兩變量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HE染色觀察 哮喘組小鼠肺組織切片HE染色可見(jiàn)肺內(nèi)支氣管黏膜下、肺內(nèi)支氣管及血管周?chē)^多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以EOS、Lym、Neu為主，黏膜下水腫，黏液腺增生，氣道上皮多處斷裂和上皮細(xì)胞的脫落，肺間質(zhì)和支氣管腔內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞滲出和分泌物，支氣管壁略顯增厚和基底膜輕度增厚且不規(guī)則，細(xì)支氣管平滑肌輕度肥大。地塞米松治療組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變較哮喘組明顯減輕。

2.2PAS染色觀察 正常對(duì)照組小鼠肺組織切片PAS染色未見(jiàn)黏液分泌；哮喘組PAS染色可見(jiàn)氣道上皮杯狀細(xì)胞增生肥大，大量黏液形成黏液栓；地塞米松治療組肺組織PAS染色與哮喘組相比杯狀細(xì)胞增生不明顯，黏液分泌明顯減少。

2.3電鏡觀察 正常對(duì)照組小鼠顯示正常肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，支氣管纖毛上皮細(xì)胞纖毛排列齊整，肺泡隔結(jié)構(gòu)正常，表面微絨毛豐富；未見(jiàn)淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞附壁及浸潤(rùn)；肺細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜、外膜清晰，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，平滑肌細(xì)胞之間有散在的膠原纖維，哮喘組小鼠電鏡觀察顯示肺間質(zhì)有EOS浸潤(rùn)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞水腫，核輕度固縮，胞漿部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，表面微絨毛部分脫落，線粒體輕度腫脹。支氣管纖毛上皮細(xì)胞纖毛排列稀疏，有斷裂、融合現(xiàn)象；肺泡腔及血管壁有多個(gè)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.4各組小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)計(jì)數(shù)的比較 見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)（±s）

表1　各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)（±s）

注：與A組比較★P＜0.01；與B組比較△P＜0.05，#P＜0.01

細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)（%）Lym　NEU　Mф　EOS A組　10　22.40 ±1.0　6.35±0.95　5.13±0.48　98.75±.6.23　0.61±.0.03 B組　10　100.28±2.24★　11.61±0.35★　11.87±0.48★　66.90±9.75★　11.33±.0.72★C組　10　58.40 ±4.43★#　9.80±1.14★#　8.91±1.26★△　70.54±10.81★△　6.31±.0.32★#組別　n　細(xì)胞總數(shù)（×107）

2.5各組BALF中IL-4、IFN-γ濃度的變化 見(jiàn)表2。

表2　各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化［pg/ml，（±s）］

表2　各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化［pg/ml，（±s）］

注：與A組比較★P＜0.01；與B組比較△P＜0.05實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因技術(shù)原因標(biāo)本不合格，故鼠數(shù)與原來(lái)每組只數(shù)不一致。

組別　鼠數(shù)（只）　IFN-γ　IL-4 A組　8　18.85±7.32　37.14±3.70 B組　8　6.20±4.38★　148.87±30.90★C組　8　8.65±3.39★　72.42±7.96★△

2.6肺組織中Gal-3蛋白的變化及NF-κB活化的比較 見(jiàn)表3。相關(guān)性分析顯示，小鼠肺組織中Gal-3表達(dá)與BALF中IL-4濃度（ r=0.791，P＜0.01）及氣道上皮NF-κB活化均成正相關(guān)（r=0.836，P＜0.01）。

表3　各組小鼠肺組織Gal-3蛋白表達(dá)情況（±s）

表3　各組小鼠肺組織Gal-3蛋白表達(dá)情況（±s）

注：與A組比較★P＜0.05，#P＜0.01；與B組比較△P＜0.01

組別　鼠數(shù)（只）　Galectin-3蛋白　NF-κB活化值A(chǔ)組　10　0.18±0.03　0.17±0.03 B組　10　0.32±0.01#　0.34±0.03# C組　10　0.22±0.02△#　0.21±0.01★△

3　討論

Gal-3由一個(gè)長(zhǎng)的N末端結(jié)構(gòu)域（調(diào)節(jié)區(qū)）和C末端的單一糖識(shí)別域（CRD結(jié)構(gòu)域），其羧基端是糖識(shí)別域組成。其是一種多效蛋白，表達(dá)與肺、腸、皮膚的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及各種炎癥細(xì)胞表面。通過(guò)與其糖結(jié)合物配體結(jié)合，使其N(xiāo)末端調(diào)節(jié)區(qū)形成寡聚化參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，單核巨噬細(xì)胞趨化（包括肺泡巨噬細(xì)胞）、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生成和凋亡，參與內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成及信號(hào)傳導(dǎo)等。Gal-3是蛋白質(zhì)復(fù)合體，包括IgE的一部分，Gal-3參與lgE及其受體結(jié)合能觸發(fā)肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞活化，刺激中性細(xì)胞過(guò)氧化物酶產(chǎn)生，激活NADPH氧化酶，促進(jìn)單核細(xì)胞脂多糖途徑誘導(dǎo)IL-1產(chǎn)生，并誘導(dǎo)單核細(xì)胞向炎癥部位趨化，這些發(fā)現(xiàn)顯示Gal-3在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Saegusa［3］等在哮喘小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與Galectin-3（+/+）小鼠相比，Galectin-3（-/-）哮喘小鼠嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，血清lgE減少，黏液分泌也顯著減少，同時(shí)減輕上皮下的纖維化、平滑肌厚度和支氣管炎周?chē)苌桑瑴p輕氣道的重塑，提示Gal-3加重的哮喘的氣道炎癥和氣道重塑。Pierluig［4］等最新的研究顯示：通過(guò)對(duì)嚴(yán)重哮喘的患者進(jìn)行奧馬珠單抗（重組化、人源化抗lgE單克隆抗體）治療后發(fā)現(xiàn)，Gal-3參與急慢性炎癥和組織纖維化的發(fā)生，在初始階段的過(guò)敏反應(yīng)，Gal-3刺激炎癥通過(guò)巨噬細(xì)胞釋放和IgE產(chǎn)生增加，最終結(jié)果是由膠原蛋白和纖連蛋白沉積形成的氣道重塑。Gal-3可以被認(rèn)為是一個(gè)可靠的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)嚴(yán)重哮喘患者氣道重塑。

本資料顯示哮喘小鼠肺組織中Gal-3蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著增高，其主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞及散在的炎性細(xì)胞，相關(guān)性分析顯示Gal-3mRNA含量與BALF中IL-4濃 度（r=0.761，P＜0.01）、BALF中細(xì)胞總數(shù)（r=0.821，P＜0.01）成正相關(guān)，與BALF中IFN-γ濃度（r=-0.634，P＜0.01）成負(fù)相關(guān)。提示急性哮喘發(fā)作期，支氣管上皮細(xì)胞及散在的炎性細(xì)胞釋放炎癥因子Gal-3明顯增多。與文獻(xiàn)報(bào)道一致［3］，蔣鯤［5］等進(jìn)一步研究哮喘患兒的支氣管肺泡灌洗液發(fā)現(xiàn)Gal-3的表達(dá)明顯增高。

NF-κB是一種調(diào)控多種細(xì)胞基因的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于胞漿，細(xì)胞靜息時(shí)極少有核表達(dá)，多數(shù)細(xì)胞中以p50 和p65 亞基的二聚體存在，由于其緊密結(jié)合的抑制蛋白IB抑制其活性。當(dāng)活化因子磷酸化I-κB后釋放出NF--κB活化轉(zhuǎn)位到核中增強(qiáng)靶基因的表達(dá)。在參與哮喘氣道炎癥的眾多因素中，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被公認(rèn)哮喘關(guān)系密切。研究表明哮喘患者氣道的重要位點(diǎn)存在活化的NF-κB，從而編碼并調(diào)控多種炎性蛋白的持續(xù)表達(dá)［6］。Lorraine等在哮喘患者氣管活檢細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)NF-κB的升高［7］。Dumic［8］等研究證實(shí)NF-κB和c-Jun氨基末端激酶共同參與調(diào)節(jié)gal-3的表達(dá)。且Gal-3基因敲除的小鼠有顯著降低的NF-κB的活性Gal-3和減少的炎癥細(xì)胞。同時(shí)，Gal-3的拮抗劑可以下調(diào)NF-κB的活性，哮喘發(fā)生時(shí)，Gal-3可能通過(guò)其配體血小板蛋白選擇配體1（PSGL-1）的協(xié)助發(fā)出誘導(dǎo)信號(hào)使NF-κB從細(xì)胞漿中脫離進(jìn)入細(xì)胞核，再通過(guò)Gal-3的表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞和血小板均呈現(xiàn)活化狀態(tài)并迅速募集，參與炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，進(jìn)一步加重哮喘的發(fā)生。

本資料哮喘模型中NF-κB和Gal-3均表達(dá)增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。而在地塞米松組中兩者的表達(dá)均降低。相關(guān)分析顯示Gal-3的變化趨勢(shì)和NF-κB的變化趨勢(shì)一致。兩者表達(dá)呈正相關(guān)性。表明哮喘肺組織中Gal-3 的表達(dá)可能由NF-κB所調(diào)控，NF-κB可能上調(diào)Gal-3 的表達(dá)，使炎癥進(jìn)一步擴(kuò)大。這為哮喘的發(fā)病機(jī)制及治療手段提供理論基礎(chǔ)，下一步對(duì)Gal-3 和NF-κB進(jìn)行更深入研究，從分子水平上進(jìn)一步探討哮喘的發(fā)病機(jī)制，為評(píng)價(jià)哮喘炎癥反應(yīng)和尋找新的治療手段提供依據(jù)。

1 Neil C. Henderson，Tariq Sethi .The regulation of inflammation by galectin-3.Immunological Reviews，2009，230： 160～171.

2 李昌崇，張維溪，陳小芳，等.巨嗜細(xì)胞炎性蛋白1及其mRNA在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用.中華兒科雜志，2004， 42（2）：90～93.

3 Saegusa J， Hsu DK， Chen HY， et al. galectin-3 is Critical for the development of the allergic inflammation response in a mouse model of atopic dermatitis. Am J Pathol， 2009， 174（3）：922～931.

4 Pierluigi M ， Anna Maria Riccio ，Rossana R，et al. Proteomics of bronchial biopsies： Galectin-3 as a predictive biomarker of airway remodelling modulation in omalizumab-treated severe asthma patients. Immunology Letters，2014，162：2～10.

5 蔣鯤，陳和斌，王瑩等.支氣管哮喘患兒血清及支氣管肺泡灌洗液中半乳糖凝集素-3和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的變化.臨床兒科雜志，2013：2～15.

6 張娟，徐青.核轉(zhuǎn)錄因子-κB與支氣管哮喘的研究進(jìn)展.國(guó)際免疫學(xué)雜志，2010，33（3）200～204.

7 Hart LA，Krishnan VL，Adcock IM，et al. Activation and localization of transcription factor，nuclear factor -kappaB，in astlrma .Am J Respir Crit Care Med，1998，158（5 Pt 1）：1585～1592.

8 Dumic J，Lauc G，flogel M.Expression of galectin-3 in cells exposed to stress-roles of jun and NF-κB.Cell physiol Biochem， 2000，10（3）：149～158.

Objective To observe the expression of Galectin-3 and NF-κB in the bronchus of a mouse model of asthma. Methods BALB/ c mice were randomly divided into three groups：the control group，asthma group and DXM treated group.In the experiment，the mouse model of asthma was established by the ovalbumin（OVA） challenge Methods. The cell numbers and differentiated cell numbers in BALF were counted by different counting fluids；Application of ELISA Methods to detect concentration IL - 4，IFN -γ in BALF；The protein expression of Galectin-3 and NF-κB were detected by Immuno-histochemistry（IHC）. Results （1）Immunohistochemical staining showed that the protein content of Galectin-3 and airway epithelial NF-κB activation expression in asthma group were significantaly higher than that of the control group；（2）There was a positive correlation between Galectin-3 and NF-κB in lung and IL-4 in BALF（P＜0.01）.

Conclusion Asthma mice lung tissue NF-κB and Galectin 3 expression are increased，the NF-κB may increase the expression of Galectin - 3.

Asthma NF-κB Galectin-3 IL-4 IFN-γ

437100湖北省咸寧市中心醫(yī)院