生姜提取物對苯并芘染毒大鼠抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶活性的影響

李　鋒,劉振偉,李慶芝,李大鵬,唐曉珍,王永麗,*

(1.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018;2.萊蕪市農業科學研究院,山東萊蕪 271100)

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生姜提取物對苯并芘染毒大鼠抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶活性的影響

李鋒1,劉振偉2,李慶芝2,李大鵬1,唐曉珍1,王永麗1,*

(1.山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018;2.萊蕪市農業科學研究院,山東萊蕪 271100)

探討生姜提取物對苯并芘染毒大鼠抗氧化酶及II相解毒酶的影響。用不同劑量的生姜提取物(100、200和400 mg/kg(bw)對Wistar大鼠連續灌胃14 d后,一次性腹腔注射20 mg/kg·bw的苯并芘染毒,檢測肝臟和腎臟中的抗氧化酶和II相解毒酶的活性。結果表明,三個劑量的生姜提取物灌胃處理對大鼠體重無顯著影響(p>0.05),同時對肝、肺和腎的臟體比也無顯著影響(p>0.05)。與苯并芘處理組相比,200和400 mg/kg·bw的生姜提取物能明顯提高肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)的活力,以及肝和腎中醌還原酶(NQO1)和谷胱甘肽硫轉移酶(GST)的活力(p<0.05)。以上結果表明,生姜提取物能顯著提高大鼠肝臟中抗氧化酶及II相解毒酶的活性。

生姜提取物,苯并芘,抗氧化,解毒酶,大鼠

生姜(ZingiberofficinaleRosc.)是姜科姜屬草木植物,在熱帶及亞熱帶地區廣泛種植[1]。在東亞及東南亞國家,生姜是常用的調味料和傳統的中藥材[2]。我國生姜種質資源豐富,栽培面積、產量及出產量均居世界首位[3]。生姜中富含姜辣素、姜油樹脂等活性成分,具有抗氧化、抗炎抑菌、解毒、止吐止泄等活性,保健和醫藥價值均較高[4-5]。

研究表明外源性親電子試劑及致癌物在體內會造成氧化損傷,導致細胞膜、核酸和蛋白質等正常的細胞成分受到損害,并最終導致多種疾病的發生[6-8]。在這些物質的體內代謝過程中,抗氧化酶和II相代謝酶構成了機體重要的防御體系[9]。抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)等,它們在清除活性氧自由基等方面發揮重要作用。II相解毒酶(如醌還原酶(NQO1)和谷胱甘肽硫轉移酶(GST)等)通過催化內源性極性物質以共價結合的形式與I相反應的活化產物或外來物質結合,從而改變其毒性[10]。通過誘導II相解毒酶,可以有效地實現對外源性致癌物及親電子試劑的代謝解毒。前期研究表明,多種生姜成分具有很強的抗氧化及II相酶誘導能力。但這些研究大多集中在生姜成分的體外活性研究,如通過DPPH等自由基清除體系評價其體外抗氧化活性[11],通過Hepa1c1c7等細胞模型研究其對醌還原酶的誘導能力[12]等。這些較強的體外作用能否在體內重現尚缺少進一步的證據來支持。而且,已有研究多采用單一的生姜化合物,而在實際飲食中生姜成分多以混合物的形式攝入。因此,本實驗以生姜提取物為原料,建立苯并芘大鼠染毒模型,研究了生姜提取物灌胃處理對大鼠抗氧化酶和II相解毒酶活性的影響,以期為生姜功能食品的開發提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮的市售生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)購自當地大潤發超市;6周齡雄性SPF級Wistar大鼠50只購于中國科學院上海實驗動物中心,許可證號:SCXK(滬)2007-2005;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉上海國藥集團化學試劑有限公司,分析純;還原型輔酶II瑞士Roche公司,分析純;苯并(α)芘(≥96.0%)百靈威科技有限公司,分析純;黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)美國Sigma-Aldrich公司,分析純;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)試劑盒南京建成生物工程研究所。

TDL-50B低速臺式離心機上海安亭科學儀器廠;Beckman Coulter Avanti J-30I高效離心機美國Beckman Coulter公司;UV-5500紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司;AL104電子天平梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司;SpectraMax M2多功能酶標儀美國Molecular Devices公司。

1.2實驗方法

1.2.1生姜提取物的制備[13]稱取200 g左右樣品洗凈、去皮、涼干后,切成1～2 mm的薄片,采用無水乙醇按照料液比1∶6(m/v)于50 ℃恒溫水浴中提取4 h,過濾,濾液采用真空旋轉蒸發濃縮至干,然后溶于100 mL水中,加入等體積的乙酸乙酯,萃取三次,合并乙酸乙酯層,真空旋轉蒸發濃縮得到生姜浸膏。經測定,浸膏中總酚含量折算為沒食子酸等價物為46.1 mg/g(Folin-Ciocalteu試劑法[14]),姜辣素的質量分數2.76%(香草醛比色法[15])。

1.2.2實驗動物及分組飼養室溫度控制在(22±1) ℃,每天保持12 h光暗交替。動物適應培養一周后,將體重相近的大鼠隨機分成五組:空白組、苯并芘致毒組(BαP組)、低劑量生姜提取物處理組(B+LG組)、中劑量生姜提取物處理組(B+MG組)和高劑量生姜提取物處理組(B+HG組)。每只大鼠單籠飼養,自由采食和飲水。生姜提取物溶于蒸餾水中,每日上午9點分別灌胃0.2 mL的生理鹽水(空白組和BαP組)、100 mg/kg·bw生姜樣品(B+LG組)、200 mg/kg·bw生姜樣品(B+MG組)、400 mg/kg·bw生姜樣品(B+HG組),連續灌胃14 d。末次灌胃1 h后,苯并芘致毒組及生姜提取物處理組大鼠均腹腔注射20 mg/kg·bw的苯并芘(溶解到玉米油中),對照組注射同等體積的玉米油,然后禁食12 h,稱取體重;處死動物,摘取肝和腎臟。按如下公式,計算臟體比:

1.2.3抗氧化酶活性的測定取一定量的肝臟組織,按照重量體積比1∶9加入生理鹽水,于組織勻漿器中制成10%的勻漿液。取部分勻漿液,于3000 r/min離心10 min,取上清液,按照試劑盒方法測定肝臟中GPx、CAT和SOD酶活性[11]。

1.2.4臟器中II相解毒酶活性的測定取一定量的肝臟和腎臟置于冰冷的Tris-KCl緩沖液(pH7.6)中,在冰浴中制成10%的勻漿液。于4 ℃下20000×g離心20 min,取上清液,繼續100000×g離心60 min,取上清液,用于測定醌還原酶(NQO1)和谷胱甘肽硫轉移酶(GST)活性。

1.2.5統計學分析實驗數據采用平均值±標準差表示,用統計學軟件SAS 8.0進行單因素方差分析(ANOVA),p<0.05時表示均值間差異顯著,p<0.01時表示均值間差異極顯著。

2　結果與分析

2.1生姜提取物對大鼠體重及臟體比的影響

如圖1所示,實驗開始前各組大鼠體重無顯著差異。經連續14 d灌胃后,空白組、BαP處理組及三個劑量的生姜提取物灌胃組之間,動物的體重增加沒有顯著性差異(p>0.05)。表明在12 h之內,20 mg/kg·bw的BαP腹腔注射處理不會顯著影響大鼠的體重。據報道,BαP腹腔注射的半數致死劑量約為500 mg/kg·bw,而本實驗中BαP的使用劑量為20 mg/kg·bw,遠低于其半數致死劑量。經過對各組動物的肝臟和腎臟的臟體比分析,各處理組之間肝、腎器官的臟體比也不存在顯著性差異(p>0.05)。

圖1　生姜提取物處理組中大鼠的體重增加值Fig.1　Body weight gains of rats treated with different doses of ginger extracts

表1　生姜提取物對苯并芘染毒大鼠肝臟抗氧化酶活力的影響

注:與空白組相比,*p<0.05,**p<0.01;與BαP組相比,#p<0.05,##p<0.01。圖2、圖3同。

2.2生姜提取物對大鼠抗氧化酶活力的影響

如表1所示,空白組中大鼠肝臟SOD的活力為(64.8±3.0) U/mg·prot,BαP處理導致動物肝臟SOD的活力顯著下降(p<0.05),為(55.2±3.5) U/mg·prot。在生姜提取物灌胃處理組中,肝臟SOD的活力分別為(56.7± 6.4) U/mg·prot(100 mg/kg·bw),(59.1± 1.7) U/mg·prot(200 mg/kg·bw)和(58.3± 4.9) U/mg·prot(400 mg/kg·bw),但與BαP處理組相比無顯著性差異(p>0.05)。

BαP組大鼠肝臟GPx酶活力為(387.6±28.6) U/mg·prot,與空白組相比(362.5±26.1) U/mg·prot無顯著差異(p>0.05)。經過連續14 d不同劑量的生姜提取物灌胃處理后,與空白組相比,生姜提取物處理組中肝臟GPx活力均極顯著升高(p<0.01);同時,與BαP組相比,200和400 mg/kg·bw的生姜提取物處理組中GPx活力顯著增加(p<0.05),100 mg/kg·bw的生姜提取物灌胃組無顯著變化(p>0.05)。對于CAT活性,BαP處理導致肝臟中CAT的活力由空白組中的(13.9±2.2) U/mg·prot顯著升高至(21.0±4.8) U/mg·prot(p<0.05)。生姜提取物灌胃處理后,肝臟中CAT酶的活力進一步升高,與空白組相比差異極顯著(p<0.01)。與BαP組相比,100、200和400 mg/kg·bw生姜提取物處理組的活力分別提高了27%、60%和63%,其中200和400 mg/kg·bw劑量組與BαP組差異極顯著(p<0.01)。這些結果表明,200和400 mg/kg·bw生姜提取物處理能在一定程度上提高動物肝臟的GPx和CAT活力,緩解BαP造成的氧化應激狀態。

2.3生姜提取物對大鼠臟器中II相解毒酶活力的影響

如圖2所示,與空白組相比,BαP處理顯著提高了動物肝臟和腎臟中NQO1酶的活力(p<0.05)。與BαP組相比,不同劑量的生姜提取物灌胃處理對肝臟及腎臟中NQO1酶活力的影響顯著。在肝臟中,低、中、高劑量生姜提取物灌胃處理均可顯著高NQO1酶的活力,經過14 d連續處理后,高劑量組酶活力最高,比BαP單獨處理組提高了94%。在腎臟中,所有處理組的NQO1酶活力均顯著高于空白組(p<0.05);與BαP組相比,中高劑量生姜提取物處理組腎臟中NQO1酶活力分別顯著提高了29%和50%(p<0.05)。以上結果表明,生姜提取物可顯著提高大鼠肝臟和腎臟中NQO1酶活力。

圖2　生姜提取物對大鼠臟器中NQO1活力的影響Fig.2　Effects of ginger extracts on quinonereductase activity in organs of rats

生姜提取物處理對大鼠臟器中GST酶活力的影響見圖3。與對照組相比,BαP刺激導致肝臟及腎臟中GST酶的活力顯著升高(p<0.05)。與BαP組相比,中高劑量的生姜提取物連續灌胃14 d,大鼠肝臟和腎臟中GST酶的活力顯著上升(p<0.05),但低劑量生姜提取物處理組與BαP組相比無顯著性差異(p>0.05)。這些結果表明,中高劑量的生姜提取物對肝臟和腎臟中GST酶的活力具有顯著的提升作用(p<0.05)。

圖3　生姜提取物對大鼠臟器中谷胱甘肽硫轉移酶活力的影響Fig.3　Effects of ginger extracts on glutathione-S transferase activity in organs of rats

3　討論

由于肝臟是BαP進行生物轉化的重要器官,也是其毒性作用主要的靶器官[17],因此,我們首先研究了生姜提取物對苯并芘染毒大鼠肝臟內抗氧化酶活力的影響。結果表明,用200和400 mg/kg·bw的生姜提取物連續灌胃14 d,能夠顯著改善BαP氧化損傷造成的肝臟GPx和CAT酶活力的下降。我們的研究結果與Kota等[18]的報道相一致,他們發現在飲食中添加5%的姜粉組與不添加的對照組相比,可以使大鼠肝臟中GPx的活性提高30%,SOD活性提高141%,CAT的活性提高94%。El-Sharaky等[19]也發現100 mg/kg·bw的生姜提取物能有效改善溴苯導致的大鼠肝臟中GPx和SOD酶活性的下降。Ahmed等[20]也發現用含1%生姜的飼料喂養大鼠,可以顯著抑制馬拉硫磷引起的大鼠抗氧化酶活性的下降,并且顯著提升大鼠血液中谷胱甘肽的含量,其作用效果與100 mg/kg·bw的抗壞血酸類似。這些結果表明,在不同的外源性毒物導致的機體氧化應激模型中,生姜提取物均表現出提高機體抗氧化酶活力的作用。

外源性毒物在體內的生物轉化主要包括I相反應和II相反應。I相反應往往會激活某些不具活性的致癌物前體,而II相反應在II相解毒酶的催化下,可通結合反應等使高活性的致癌物失活,起到真正解毒作用。因此,誘導II相解毒酶的表達,可以有效促進II相反應,保護機體免受毒性物質和活性氧的侵害。其中,NQO1和GST酶是體內主要的代表性II相解毒酶,NQO1可催化多種醌類及其衍生物發生失去兩個電子的還原反應,從而保護細胞免受其代謝過程中產生的反應活性氧及親電子物質的損傷[21]。GST酶催化GSH與多種致癌劑的親電中心結合,形成硫醚連接的谷胱甘肽結合物,改變其極性從而利于其排出體外[22]。很多研究證實,具有癌癥化學預防作用的植物化學物質大多具有較強的II相解毒酶誘導活性[23]。在本研究中我們發現,與BαP處理組相比,中高劑量的生姜提取物處理組具有顯著提升大鼠肝臟和腎臟中的NQO1和GST酶活力的能力。本文的研究結果與Nirmala[24]等人的報道一致。目前,有關生姜提取物體內誘導II相解毒酶作用的研究報道相對較少。但是體外細胞模型研究證實很多生姜成分具有較強的II相解毒酶誘導能力,如6-脫氫姜烯酚和1-脫氫-6-姜二酮等能顯著誘導鼠肝癌Hepa1c1c7細胞中NQO1的活性[12]。本研究發現生姜提取物具有較強的體內誘導II相解毒酶的能力,可能與這些成分的共同作用有關。

4　結論

用100、200和400 mg/kg·bw的生姜提取物對Wistar大鼠連續灌胃14 d,各處理組間動物體重沒有顯著性差異,肝、肺和腎的臟體比也無顯著差異(p>0.05)。與BαP處理組相比,200和400 mg/kg·bw的生姜提取物能明顯提高肝臟中抗氧化酶GPx和CAT的活力(p<0.05),但對SOD酶影響不顯著;200和400 mg/kg·bw的生姜提取物對肝和腎中主要的II相解毒酶NQO1和GST的活力也具有顯著的提升作用(p<0.05)。以上結果表明,生姜提取物通過提高大鼠肝臟中主要抗氧化酶及II相解毒酶的活性,能夠提高機體的抗氧化能力和對苯并芘的代謝解毒作用。這些發現對于揭示生姜這一藥食兼用植物的保健作用提供了參考,同時也可為開發高附加值的生姜功能食品及新型藥品提供一定的實驗依據。

[1]陳燕,倪元穎,蔡同一. 生姜提取物的綜合利用與深加工研究[J]. 食品工業科技,2000,21(4):76-78.

[2]El-Abhar HS,Hammad LN,Gawad HS. Modulating effect of ginger extract on rats with ulcerative colitis[J]. Journal of Ethnopharmacology,2008,118(3):367-372.

[3]李秀,徐坤,鞏彪. 生姜種質遺傳多樣性和親緣關系的SRAP分析[J]. 中國農業科學,2014,47(4):718-726.

[4]Baliga MS,Haniadka R,Pereira MM,et al. Update on the chemopreventive effects of ginger and its phytochemicals[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2011,51(6):499-523.

[5]Terry R,Posadzki P,Watson LK,et al. The use of ginger(Zingiber officinale)for the treatment of pain:a systematic review of clinical trials[J]. Pain Medicine,2011,12(12):1808-1818.

[6]劉文博,譚曉斌,賈曉斌,等. 基于Nrf2通路的中藥化學預防腫瘤的研究思路[J]. 中草藥,2011,42(7):1429-1434.

[7]Hayashi G,Cortopassi G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases[J]. Free Radical Biology and Medicine,2015,88(A):10-17.

[8]Kowluru RA,Mishra M. Oxidative stress,mitochondrial damage and diabetic retinopathy[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease,2015,1852(11):2474-2483.

[9]張圣方,趙龍玉,王雪,等. 泰山蛹蟲草多糖對免疫抑制小鼠血清蛋白含量和體內抗氧化能力的影響[J]. 食品工業科技,2015,36(11):332-335.

[10]Lee MS,Lee B,Park KE,et al. Dieckol enhances the expression of antioxidant and detoxifying enzymes by the activation of Nrf2-MAPK signalling pathway in HepG2 cells[J]. Food Chemistry,2015,174(1):538-546.

[11]Kim KC,Kang KA,Zhang R,et al. Up-regulation of Nrf2-mediated heme oxygenase-1 expression by eckol,a phlorotannin compound,through activation of Erk and PI3K/Akt[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2010,42(2):297-305.

[12]Li F,Wang YL,Parkin KL,et al. Isolation of quinone reductase(QR)inducing agents from ginger rhizome and theirinvitroanti-inflammatory activity[J]. Food Research International,2011,44(6):1597-1603.

[13]Li F,Nitteranon V,Tang XZ,et al.Invitroantioxidant and anti-inflammatory activities of 1-dehydro-[6]-gingerdione,6-shogaol,6-dehydroshogaol and hexahydrocurcumin[J]. Food Chemistry,2012,135(2):332-337.

[14]Singleton VL,Orthofer R,Lamuela-Raventós RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent,in Methods in Enzymology[M].

1999,Academic Press,152-178.

[15]張明昶,李健,蒙繼昭. 紫外分光光度法測定姜中姜辣素類化合物的含量[J]. 貴州醫藥,2003,27(3):283-284.

[16]Terry EN,Ganna PH,Molokie R,et al. Changes in the activity of the GPx-1 anti-oxidant selenoenzyme in mononuclear cells following imatinib treatment[J]. Leukemia Research,2011,35(6):31-833.

[17]史巧巧,席俊,陸啟玉. 食品中苯并芘的研究進展[J]. 食品工業科技,2014,35(5):379-381.

[18]Kota N,Krishna P,Polasa K. Alterations in antioxidant status of rats following intake of ginger through diet[J]. Food Chemistry,2008,106(3):991-996.

[19]El-Sharaky AS,Newairy AA,Kamel MA,et al. Protective effect of ginger extract against bromobenzene-induced hepatotoxicity in male rats[J]. Food and Chemical Toxicology,2009,47(7):1584-1590.

[20]Ahmed RS,Seth V,Pasha ST. Influence of dietary ginger(Zingiber officinales Rosc)on oxidative stress induced by malathion in rats[J]. Food and Chemical Toxicology,2000,38(5):443-450.

[21]Ross D,Kepa JK,Winski SL,et al. NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1(NQO1):chemoprotection,bioactivation,gene regulation and genetic polymorphisms[J]. Chemico-Biological Interactions,2000,129(1-2):77-97.

[22]Yang CS. Dietary factors may modify cancer risk by altering xenobiotic metabolism and many other mechanisms[J]. Journal of Nitrition,2006,136(10):2685S-2686S.

[23]Russo GL. Ins and outs of dietary phytochemicals in cancer chemoprevention[J]. Biochemical Pharmacology,2007,74(4):533-544.

[24]Nirmala K,Prasanna Krishna T,Polasa K. Modulation of xenobiotic metabolism in ginger(Zingiber Officinale Roscoe)fed rats[J]. International Journal of Nutrition and Metabolism,2010,2(3):56-62.

Effects of ginger extract on activities of antioxidant enzymes and phase II detoxifying enzymes in benzo(α)pyrene-treated rats

LI Feng1,LIU Zhen-wei2,LI Qing-zhi2,LI Da-peng1,TANG Xiao-zhen1,WANG Yong-li1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China;2.Laiwu Academy of Agricultural Science,Laiwu 271100,China)

The aim of this study was to investigate the effects of ginger extract on activities of antioxidant enzymes and phase II enzymes in benzo(α)pyrene(BαP)-treated rats. Wistar rats were fed by gavage with different doses of ginger extract 100,200 and 400 mg/kg·bw for 14 days. After 14 day of feeding,20 mg/kg·bw of BαP was intraperitoneally injected to the rats. Afterwards,the animals were sacrificed and their livers and kidneys were collected for analysis of antioxidant enzymes and phase II enzymes. Results showed that three doses of ginger extract did not significantly affect body weight of the rats(p>0.05),as well as the organs to body weight ratios(p>0.05). Compared with the BαP group,both 200 and 400 mg/kg·bw of ginger extract significantly elevated the activities of glutathione peroxidase(GPx)and catalase(CAT)in liver,as well as the activities of quinone reductase(NQO1)and glutathione S-transferase(GST)in liver and kidney(p<0.05). These results suggested that ginger extract could improve the activities of antioxidant enzymes and phase II enzymes in rats.

ginger extract;benzo(α)pyrene;antioxidant enzymes;detoxifying enzymes;rats

2015-10-26

李鋒(1983-)，男，博士，講師，研究方向：食品營養化學，E-mail:lifeng0605@163.com。

王永麗(1982-)，女，博士，講師，研究方向：食品安全與質量控制，E-mail:lily8941@163.com。

國家自然科學基金項目(31201417)；中國博士后科學基金(2013M540561)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)12-0350-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.058