響應面法優化落葉松阿拉伯半乳聚糖閃式提取工藝及其性質研究

陳　苑,李建霞,朱瑞倩,孫蒙蒙,董潔瓊,王建中，*

(1.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083；2.北京林業大學自然保護區學院，北京 100083)

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響應面法優化落葉松阿拉伯半乳聚糖閃式提取工藝及其性質研究

陳苑1,李建霞2,朱瑞倩1,孫蒙蒙1,董潔瓊1,王建中1，*

(1.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083；2.北京林業大學自然保護區學院，北京 100083)

以華北落葉松為原料,采用閃式提取技術對落葉松中的阿拉伯半乳聚糖進行提取,在單因素實驗的基礎上,利用響應面法對閃提工藝進行優化,最終得到較優提取工藝參數為:提取溫度為70 ℃,閃提時間為1.6 min,料液比為1∶16(g/mL),提取時間為22 min,此條件下阿拉伯半乳聚糖提取率為14.30%±0.05%。通過掃描電鏡觀察阿拉伯半乳聚糖樣品,發現其呈不規則幾何外形分布。通過紅外吸收峰的分析,發現樣品含有糖類化合物的典型基團,且趨勢和標準品基本一致。

落葉松,阿拉伯半乳聚糖,閃式提取,掃描電鏡,紅外

阿拉伯半乳聚糖(Larixgmelinii)是從植物細胞壁中獲得的一種活性多聚糖,由阿拉伯糖與半乳糖組成,是一類長的、高度支鏈的中性多糖[1]。國外學者對阿拉伯半乳聚糖的研究表明其具有較好的免疫活性[2],能夠刺激免疫系統,阻斷腫瘤細胞向肝臟轉移[3],可能成為用于癌癥治療的一個有效輔助物。同時阿拉伯半乳聚糖也是一種良好的膳食纖維,攝入后能促進腸道內有益菌群數量增多[6]。在針葉樹的木質部中大量含有此糖,尤其在落葉松(Larix)中可達5%～30%[7]。

目前國內對阿拉伯半乳聚糖的研究主要集中于分析其化學結構[8],微波提取[9]及超聲波提取[10]工藝條件,閃式提取法(簡稱為閃提法)是近年來發展起來的一種新的提取技術,它利用閃式提取機的高速機械剪切力、攪拌力以及高速旋轉的刀刃之間產生的渦流負壓,迅速破壞植物組織細胞,使細胞內部的化學成分(或有效成分)與溶劑充分接觸,溶解轉移,并在很短時間內達到溶解平衡,實現高效提取的目的[11],具有快速高效、常溫提取、無成分破壞等特點[12]。本研究以落葉松為原料,利用閃式提取技術對其中阿拉伯半乳聚糖進行提取,通過響應面設計優化提取條件,得到最佳提取工藝,并利用掃描電鏡分析其表面特征及紅外光譜分析阿拉伯半乳聚糖特征基團。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

落葉松購自河北賽罕壩機械林場;L-阿拉伯糖(≥99%)、D-半乳糖標準品(≥99%)、阿拉伯半乳聚糖標準品(≥99%)Sigma公司;苯酚、四水合酒石酸鉀鈉AR,西隴化工股份有限公司;濃硫酸、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、葡萄糖AR,北京化工廠;無水乙醇AR,天津市光復科技發展有限公司;3,5-二硝基水楊酸CP,廣東光華化學廠有限公司;針式濾膜過濾器過濾頭Ф25 mm×0.45 μm天津市科億隆實驗設備有限公司。

FDV型氣引式超細粉碎機臺灣佑崎企業;HJ-3型恒溫磁力攪拌器常州國華電器有限公司;JHBE-50S型閃式提取器北京金鼐科技發展有限公司;R-210型旋轉蒸發儀瑞士BUCHI公司;T6型新世紀型紫外分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡、E-1010型濺射鍍膜機日本日立公司;Spectrum 100型FT-IR Spectrometer紅外光譜儀美國PerkinElmer公司。

1.2實驗方法

1.2.1總糖標準曲線的制作采用苯酚-硫酸法[14]。分別取0.2 mg/mL標準液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于試管中,各補加蒸餾水至2.0 mL,然后依次加入1.0 mL 6%的苯酚溶液,搖勻,迅速加入5.0 mL濃硫酸,靜置10 min,搖勻,室溫放置20 min,于490 nm測量吸光度A值。以2.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白對照。

1.2.2還原糖標準曲線的制作采用3,5-二硝基水楊酸比色法[15]。精確吸取1.0 mg/mL的葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,各補加蒸餾水至1.0 mL,再加入3,5-二硝基水楊酸試劑1.5 mL,搖勻,沸水浴5 min后迅速冷卻,加入8.0 mL蒸餾水,混勻,放置20 min后,于550 nm測量吸光度A值。以1.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白對照。

1.2.3落葉松阿拉伯半乳聚糖得率測定將落葉松木屑用粉碎機粉碎,過40目篩,得落葉松木粉。準確稱取10.0 g本品粉末,加入一定量蒸餾水,在一定條件下進行閃式提取,然后放于恒溫磁力攪拌器上進行提取,結束后靜置,用注射器吸取上清液,通過針式濾膜過濾器過濾頭,將濾液收集,以制備標準曲線的方法,測定總糖及還原糖的含量。并利用回歸方程得到落葉松樣品中總糖含量及還原糖含量,按下列公式計算阿拉伯半乳聚糖的含量[14]。

阿拉伯半乳聚糖含量=總糖含量-還原糖含量

阿拉伯半乳聚糖得率(%)=(阿拉伯半乳聚糖質量/落葉松木粉質量)×100

1.2.4單因素實驗設計以提取溫度、閃提時間、料液比、提取時間四個因素為研究對象,以落葉松阿拉伯半乳聚糖得率為指標,進行單因素實驗。

1.2.4.1提取溫度對得率的影響分別準確稱取落葉松木粉10.0 g,閃提時間1 min,料液比1∶15,提取時間30 min,在提取溫度為35、45、55、65、75、85 ℃下分別提取。進行三次平行實驗,比較結果確定最佳提取溫度。

1.2.4.2閃提時間對得率的影響分別準確稱取落葉松木粉10.0 g,以提取溫度45 ℃,料液比1∶15,提取時間30 min,在閃提時間依次0、0.5、1、1.5、2 min分別提取。進行三次平行實驗。比較結果確定最佳閃提時間。

1.2.4.3料液比對得率的影響分別準確稱取落葉松木粉10.0 g,以提取溫度45 ℃,閃提時間1 min,提取時間30 min,在料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30下提取。進行三次平行實驗。比較結果確定最佳提取料液比。

1.2.4.4提取時間對得率的影響分別準確稱取落葉松木粉10.0 g,以提取溫度45 ℃,閃提時間1 min,料液比1∶15,在提取時間為0、20、40、60、80、100 min,分別提取。進行三次平行實驗。比較結果確定最佳提取時間。

1.2.5響應面實驗設計在單因素實驗的基礎上,根據響應面實驗設計原理,運用Design Expert 8.0.6軟件程序,根據 Box-Behnken 中心組合實驗設計原理,采用四因素三水平的響應面分析法,以A(提取時間)、B(料液比)、C(提取溫度)、D(閃提時間)為自變量,以阿拉伯半乳聚糖的得率為響應值,通過響應曲面分析(response surface analysis,RSA)對提取條件進行優化。實驗因素及水平見表1。

表1　響應面實驗因素與水平對照表

按照響應面設計實驗得出的最優組合進行阿拉伯半乳聚糖的提取,計算得率。

1.2.6阿拉伯半乳聚糖的性質分析

1.2.6.1阿拉伯半乳聚糖的表觀性質分析在掃描電子顯微鏡(SEM)設備下觀察冷凍干燥后的阿拉伯半乳聚糖的表面形態。檢測前,使用濺射鍍膜機對材料表面進行噴金,掃描電鏡采用10 kV的加速電壓。

1.2.6.2阿拉伯半乳聚糖的紅外光譜分析取少量樣品置于紅外光譜儀中進行測定,Spectrum 100型FT-IR Spectrometer紅外光譜儀對阿拉伯半乳聚糖及單糖標準品進行紅外測定,掃描分辨率2 cm-1,掃描范圍為4000～400 cm-1,并對樣品和單糖標準品的光譜結果進行比對鑒定。

1.3數據處理

分別采用Microsoft Excel(Office 2007)軟件、Design Expert 8.0.6軟件進行數據整理與分析。

2　結果與分析

2.1標準曲線制作

2.1.1總糖標準曲線制作得到總糖標準曲線,如圖1所示,得到回歸方程:C=11.239A-0.0769(R2=0.9950)。

圖1　總糖標準曲線Fig.1　Standard curve of total sugar

2.1.2還原糖標準曲線制作得到還原糖標準曲線,如圖2所示,回歸方程C=12.393A-0.0313(R2=0.9992)。

圖2　還原糖標準曲Fig.2　Standard curve of sugar

2.2單因素實驗結果

2.2.1提取溫度的選擇提取溫度對阿拉伯半乳聚糖得率的影響如圖3所示。實驗結果表明,隨著提取溫度的升高,阿拉伯半乳聚糖得率逐漸增大,在55 ℃以下增長速率較遲緩,55～65 ℃得率增長較快,65 ℃以后得率幾乎不變。由于目標提取物是一種活性多糖,為了避免溫度過高而使其失去生物活性,同時為了減少雜質的溶出,因此,選擇65 ℃為最佳提取溫度。

圖3　溫度對阿拉伯半乳聚糖提取得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on extraction yield of arabinogalactan

2.2.2閃提時間的選擇不同閃提時間對阿拉伯半乳聚糖得率的影響如圖4,加入水后立即取樣與閃提后立即取樣兩個數據結果得出閃提能夠顯著增加阿拉伯半乳聚糖的得率。隨著閃提時間的增長,阿拉伯半乳聚糖得率不斷上升,在閃提時間為1.5 min時得率最高,之后得率變化不大,這說明目標產物幾乎完全提出。因此,在保證目標產物完全浸出的情況下,閃提時間越小越好,故本實驗選取1.5 min為最佳閃提時間。

圖4　閃提時間對阿拉伯半乳聚糖提取得率的影響Fig.4　Effect of flash-extraction time on extraction yield of arabinogalactan

2.2.3料液比的選擇料液比對阿拉伯半乳聚糖得率的影響如圖5。隨著料液比的增大,阿拉伯半乳聚糖不斷上升,在料液比為1∶15時,得率最高,繼續增大料液比對得率影響不大。因此選取1∶15為最佳料液比。

圖5　料液比對阿拉伯半乳聚糖提取得率的影響Fig.5　Effect of ratio of solid to liquid on extraction yield of arabinogalactan

圖6　提取時間對阿拉伯半乳聚糖提取得率的影響Fig.6　Effect ofratio of extraction time on extraction yield of arabinogalactan

2.2.4提取時間的選擇提取時間對阿拉伯半乳聚糖得率的影響如圖6。隨著提取時間的增長,阿拉伯半乳聚糖得率增加不明顯,這可能是由于閃提能夠顯著提高阿拉伯半乳聚糖的得率,之后再攪拌提取對其得率影響不大,在攪拌20 min時,得率最高,隨著攪拌時間的增長,得率增加不明顯,考慮到實際應用中節約成本,提取時間越短越好,故本實驗選取最佳提取時間為20 min。

2.3響應面分析結果

2.3.1響應面模型回歸分析以A(提取時間)、B(料液比)、C(提取溫度)、D(閃提時間)為變量,以阿拉伯半乳聚糖的提取得率為響應值,按響應面軟件Design Expert 8.0.6 提供設計的組合進行實驗,得到結果見表2。

表2　響應面設計方案及結果

采用Design Expert 8.0.6軟件,對表2中的實驗數據進行回歸分析,得出阿拉伯半乳聚糖得率的回歸方程如下:Y=13.85+0.10A+0.082B+0.81C+0.042D-0.077AB-0.038AC+0.050AD-0.022BC+0.020BD-0.010CD-0.22A2-0.25B2-0.39C2-0.096D2。其決定系數R2=0.9893,說明回歸方程適用于阿拉伯半乳聚糖的理論預測值。對回歸方程做顯著性檢驗與方差分析,結果見表3。

通過表3可以直觀看到,模型顯著性檢驗為極顯著,p<0.0001,失擬項p為 0.3010>0.05,說明該模型與實驗擬合度良好。模型的二次項A2、B2、C2和一次項C達到極顯著水平,p<0.0001;一次項A和B達到高度顯著水平,p<0.01;另外二次項D2達到顯著水平,p<0.05。通過對Y的回歸系數的檢驗可知,各因素對阿拉伯半乳聚糖得率影響的大小順序為:提取溫度(C)>提取時間(A)>料液比(B)>閃提時間(D)。

圖7　阿拉伯半乳聚糖樣品的掃描電鏡圖Fig.7　Scanning picture of arabinogalactan by SEM

2.3.2優化提取工藝條件的確定經過軟件優化得到的提取工藝為,提取溫度為70 ℃,閃提時間為1.61 min,料液比為1∶15.52(g/mL),提取時間21.52 min,優化預測的得率值14.2838%。經實驗檢驗,此時得到的阿拉伯半乳聚糖的實際得率14.32%,與理論預測值接近,證明該回歸模型具有可靠性。為了實際的操作方便,將阿拉伯半乳聚糖的提取工藝參數修正為:提取溫度為70 ℃,閃提時間為1.6 min,料液比為1∶16(g/mL),提取時間為22 min,并在此工藝參數條件下進行三次平行實驗,實際測得阿拉伯半乳聚糖的得率為14.30%±0.05%,與預測值相差很小,說明該模型與實際擬合度良好,用于預測實驗結果比較可靠,具有實用價值。

2.4樣品的電鏡掃描分析

掃描電鏡結果可直接觀察試樣的表面形貌,圖像具有整體的立體感。在低倍鏡下,可觀察試樣表面凹凸不平,顆粒大小不一,較小顆粒依附在較大顆粒周圍,試樣表面帶有小孔洞,呈蜂窩狀。在較高倍鏡下,可以清楚地看見顆粒的形狀,顆粒呈不規則的幾何外形,表面平滑,顆粒彼此相互堆積在一起,在固體狀態下多以大的聚集態存在。即使放大倍率也是光滑表面,沒有清晰細節,不能獲得多糖聚集體的微觀形貌信息。關于落葉松多糖的結構還需要進一步分析。

表3　二次響應面回歸模型方差分析

注:*表示具有顯著性p<0.05;**表示具有高度顯著性p<0.01，具極顯著性p<0.001。

2.5阿拉伯半乳聚糖紅外結果分析

圖8　樣品紅外光譜圖Fig.8　Infrared(IR)spectra of the samples

阿拉伯半乳聚糖樣品的紅外光譜圖如圖8所示,阿拉伯半乳聚糖標準品的紅外光譜圖如圖9所示,阿拉伯半乳聚糖樣品的紅外光譜分析結果顯示,3419.48 cm-1的寬強吸收峰是分子間氫鍵締合的O-H的伸縮振動,2924.49 cm-1的吸收峰表明含有C-H的伸縮振動,兩者是糖類的特征吸收峰,同時說明阿拉伯半乳聚糖中含有大量H鍵,1607.19 cm-1的吸收峰是C=O非對稱伸縮振動,1400～1300 cm-1的一些吸收峰是C-H 變角振動,1300～670 cm-1為指紋區,1139.69 cm-1的吸收峰是C-O伸縮振動,947.23 cm-1的吸收峰是O-H彎曲振動,843.84 cm-1的吸收峰是α-端基差向異構體的C-H變角振動,指紋區吸收峰與標準品圖譜的比較,可以得出定性結論。

根據指紋區吸收峰做定性分析,樣品在指紋區的特征吸收頻率有1139.69,995.15,947.23,843.84 cm-1,分別與標準品阿拉伯半乳聚糖在指紋區的特征吸收頻率1134.15,994.47,946.14,844.62 cm-1相一致。指紋區域的樣品吸收峰位置與標準品位置一致,結合以上官能團區域的分析,樣品可定性為阿拉伯半乳聚糖。

圖9　標準品紅外光譜圖Fig.9　Infrared(IR)spectra of the standards

3　結論

本實驗采用閃式提取法,并通過響應面實驗設計原理得出了落葉松中阿拉伯半乳聚糖閃式提取的優化工藝。得到最佳提取工藝參數為:溫度70 ℃,閃提時間1.6 min,料液比1∶16,提取時間22 min。此條件下阿拉伯半乳聚糖的提取率為14.30%±0.05%。利用電鏡掃描觀察落葉松阿拉伯半乳聚糖樣品,發現其基本呈不規則幾何形狀分布。以阿拉伯糖及半乳糖標準品作為對比,對落葉松阿拉伯半乳聚糖樣品進行紅外光譜分析,樣品出現糖類的特征吸收峰,并且根據指紋區吸收峰做定性分析,樣品在指紋區的特征吸收頻率與標準品相一致,可定性為阿拉伯半乳聚糖。

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Optimization of flash-extraction of larch arabinogalactan using response surface analysis and its characterization

CHEN Yuan1,LI Jian-xia2,ZHU Rui-qian1,SUN Meng-meng1,DONG Jie-qiong1,WANG Jian-zhong1,*

(1.College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.School of Nature Conservation,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

The North China larch was used as the raw material to extract larch arabinogalactan by flash-extraction,based on single factor experiments,extraction condition was optimized by the response surface analysis. The results showed that the optimal conditions of extraction of the larch arabinogalactan from the North China larch were as follows:extraction temperature 70 ℃,flash-extraction time 1.6 min,solid-to-liquid(g/mL)ratio 1∶16 and extraction time 22 min. Under this condition,the maximal content of larch arabinogalactan was up to 14.30%±0.05%. By using scanning electron microscopy(SEM)analysis of the arabinogalactan samples,it was found that its distribution was the irregular geometry. And the infrared spectrum(IR)analysis showed that it contained a typical groups of saccharide compounds,also its trend was almost consistent with the standards.

larch;arabinogalactan;flash-extraction;SEM;IR

2015-09-08

陳苑(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產物提取，E-mail：zicheny2004@163.com。

王建中(1952-)，男，教授，研究方向：林產品加工利用，E-mail：w62338221@163.com。

林業公益性行業科研專項(201004081)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0306-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.049